荔枝核总黄酮对肝纤维化大鼠肝组织TLR4/NF-κB信号通路的影响*

何志国，赵永忠，卢青，周英琼，肖绪华，侯巧燕，黄大健，成秋宸

(桂林医学院附属医院 1.消化内科;2.病理科，桂林 541004)

荔枝核总黄酮对肝纤维化大鼠肝组织TLR4/NF-κB信号通路的影响*

何志国1，赵永忠1，卢青1，周英琼2，肖绪华1，侯巧燕2，黄大健1，成秋宸1

(桂林医学院附属医院 1.消化内科;2.病理科，桂林 541004)

目的 探讨荔枝核总黄酮(TFL)对胆管阻塞型肝纤维化大鼠肝组织Toll样受体4(TLR4)、核因子κB(NF-κB)表达的影响。方法雄性SPF级SD大鼠80只,随机分为正常对照组、模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组。除正常对照组外,其余各组均采用胆总管结扎法(CBDL)制备肝纤维化大鼠模型。造模后第2天开始,正常对照组、模型组给予0.9%氯化钠溶液灌胃(5 mL·kg-1),TFL小剂量组给予TFL 100 mg·kg-1、TFL大剂量组给予TFL 200 mg·kg-1灌胃,均每天1次,共4周,第4周末处死大鼠,留取肝脏组织。苏木精-伊红(HE)染色、Masson染色观察大鼠肝组织病理学改变,免疫组化法(IHC)检测TLR4、NF-κB在4组大鼠肝组织内的表达。结果与模型组比较,TFL大剂量组肝组织纤维化程度明显减轻,胶原表达明显减少(P＜0.01);正常对照组、模型组、TFL小剂量组、TFL大剂量组的大鼠肝组织TLR4免疫组化评分分别为(0.4±0.5),(3.3±0.6),(3.1±0.5),(1.4±0.5)分;NF-κB免疫组化评分分别为(0.80± 0.77),(5.12±0.89),(4.68±0.70),(3.47±0.61)分,模型组TLR4、NF-κB表达明显高于正常对照组和TFL大剂量组(P＜0.01),与TFL小剂量组比较,差异无统计学意义。结论TLR4和NF-κB高表达可能与胆管阻塞型大鼠肝纤维化的发生发展有关,大剂量荔枝核总黄酮可能通过抑制大鼠肝组织TLR4、NK-κB的表达来改善胆管阻塞型大鼠肝纤维化程度。

荔枝核总黄酮；肝纤维化；Toll样受体4；核因子-κB

肝纤维化是指以胶原为主的细胞外基质在肝脏内过度沉积,是多种慢性肝病共有的、渐进性的病理阶段,其中细胞因子的表达异常在肝纤维化发生发展中起着关键作用。Toll样受体(toll-like receptors,TLRs)作为细胞膜上的跨膜信号传递分子,可通过信号转导参与配体介导的肝脏内多种细胞的激活及多种细胞因子的分泌,在肝纤维化的发生及发展机制中具有重要的作用[1]。核因子κB(nuclear factor-kappa-B,NF-κB)位于TLR下游信号通路的枢纽位置,细胞受到生物刺激后激活NF-κB,活化的NF-κB进入细胞核调节炎性细胞因子的表达,参与炎症反应及肝纤维化过程[2]。荔枝核提取物具有行气散结、驱寒止痛之功效。近年的研究表明,荔枝核总黄酮(total flavone of Litchi Chinensis Sonn,TFL)是荔枝核中具有药理活性的主要成分之一,具有抗病毒[3-4]、抗肝损伤[5]和抗氧化[6]等作用。现有研究结果表明,姜黄素及TFL均具有抗胆管阻塞型大鼠肝纤维化作用[7-9]。迄今为止,有关肝纤维化过程中TLR4蛋白在肝组织内表达的情况鲜有报道。笔者在本研究中以胆总管结扎所致大鼠肝纤维化模型为研究对象,进一步探讨TFL对胆管阻塞型大鼠肝组织中TLR4和NF-κB表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 SPF级雄性SD大鼠80只,体质量(200± 20)g,由桂林医学院实验动物中心提供,动物许可证号: SCXK(桂)2007-0001。TLR4、NF-κB蛋白检测所用Ⅰ抗为兔抗小鼠多克隆抗体,均购自Bioworld公司,Ⅱ抗为辣根过氧化物酶偶联羊抗兔IgG,购自北京中山金桥生物技术有限公司。超敏发光试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。即用型SP试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。TFL由桂林工学院有机化学教研室加工提取,经检测TFL含量为852 g·kg-1,将其粉末状物用纯化水稀释成40 g·L-1溶液。

1.2 动物分组及处理 参照文献[10]制备胆总管阻塞性肝纤维化大鼠模型,将80只SD大鼠随机分成4组,即正常对照组、模型组、TFL小剂量组和TFL大剂量组,每组20只。模型组大鼠1%戊巴比妥钠(4 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后正中开腹,游离胆总管,双重结扎,两结扎线中间剪断后关腹。正常对照组大鼠游离胆总管而不结扎,关腹。其余组同模型组。术后第2天开始分组给药。①正常对照组:0.9%氯化钠溶液灌胃,5 mL·kg-1·d-1;②模型组:同正常对照组;③TFL小剂量组:TFL灌胃,100 mg·kg-1·d-1;④TFL大剂量组:TFL灌胃,200 mg·kg-1·d-1。均每天1次,共4周,第4周末全部处死,留取各组肝脏组织。

1.3 肝脏组织病理学检查 取相同部位肝脏,用4%甲醛固定,石蜡包埋,切片,行苏木精-伊红(hematoxylineosinstaining,HE)染色,光镜下观察肝脏病理变化并参考文献[11]进行分期。常规Masson染色,胶原纤维组织染成绿色,每张切片随机选取高倍视野5个,Leica Qwin V3图像分析系统(德国Leica公司)计算每个视野胶原纤维面积。

1.4 采用免疫组化法(IHC)检测TLR4、NF-κB的表达 严格按照SP试剂盒操作说明进行。I抗稀释浓度1∶100。参考文献[12]对各蛋白在肝组织中的阳性表达进行半定量分析。

1.5 统计学方法 应用SPSS17.0版软件进行数据处理,实验数据以均数±标准差(±s)表示,分析前行正态性检验方差齐性检验,如符合条件,采用完全随机设计资料的单因素方差分析,不符合条件,采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 本实验共有9只大鼠死亡,均不进入统计数据。胆总管结扎后大鼠活动及摄食减少,精神萎靡,1～6 d后,耳朵、眼睛、双爪出现黄染,尿液呈浓茶色,取模型组大鼠肝脏组织时,发现其肝脏呈深黄色,变形且增大,表面结节样改变,边缘圆钝,胆管扩张膨出伴胆汁淤积,质硬。

2.2 各组大鼠肝组织病理学检测结果 HE染色(图1)见正常对照组大鼠肝脏组织肝小叶结构完整,肝细胞排列整齐,无炎症坏死及纤维增生。模型组大鼠肝脏组织肝小叶结构及肝细胞索排列紊乱,大量肝细胞坏死,肝实质内及胆管周围可见不同程度的胶原沉积,汇管区、汇管区之间、汇管区与中央静脉之间小胆管弥漫性增生,部分可见假小叶形成,病理分期以Ⅲ、Ⅳ期为主;TFL小剂量组汇管区小胆管增生明显,纤维间隔伴小叶结构紊乱,较TFL大剂量组明显,但不及模型组,以Ⅲ、Ⅳ期为主;TFL大剂量组汇管区增生较模型组明显缩小,偶见点、灶状坏死,纤维组织增生减少,肝小叶结构趋于正常,中央静脉周围见少量胶原沉积,汇管区周围纤维化,界限清楚,病理分期以Ⅰ、Ⅱ期为主, TFL大剂量组肝纤维化程度明显低于模型组。Masson染色结果(图2)提示模型组胶原纤维面积与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01),TFL大剂量组胶原纤维面积与模型组相比差异有统计学意义(P＜0.01),TFL小剂量组胶原纤维面积与模型组相比差异无统计学意义。各组肝纤维化程度分期及胶原纤维面积具体数值见表1,2。

表1 4组大鼠肝组织肝纤维化程度分期结果Tab.1 Stage results of liver fibrosis in 4 groups of rats 只

表2 4组大鼠Masson染色胶原纤维面积计算结果Tab.2 Collagen fiber area of liver tissue by Masson staining in 4 groups of rats ±s

表2 4组大鼠Masson染色胶原纤维面积计算结果Tab.2 Collagen fiber area of liver tissue by Masson staining in 4 groups of rats ±s

与模型组比较,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

组别大鼠/只胶原纤维面积/μm2TFL小剂量组161 092.7±105.2大剂量组19772.9±168.9*1模型组161 172.5±108.4正常对照组20377.4±19.8

2.3 IHC检测肝组织TLR4、NF-κB的表达 TLR4主要表达于肝细胞、库普弗细胞、内皮细胞以及胆管上皮细胞等多种细胞的细胞质和细胞膜。正常对照组肝组织内TLR4蛋白呈阴性或弱阳性表达,模型组肝组织中TLR4的蛋白的表达均明显高于正常对照组,呈淡黄色、棕黄色或棕褐色染色,差异有统计学意义(P＜0.01)。TFL小剂量组肝组织内TLR4蛋白阳性表达低于模型组,差异无统计学意义(P＞0.05)。TFL大剂量组肝组织内TLR4蛋白表达较模型组明显降低,大部分以淡黄色染色为主,偶见棕黄色及棕褐色染色,差异有统计学意义(P＜0.01)。NF-κB的表达:正常对照组及TFL大剂量组大鼠肝组织内仅呈弱阳性表达,而在模型组及TFL小剂量组肝组织细胞质或细胞核可观察到明显棕色颗粒,NF-κB呈强阳性。各组免疫组织评分及化学染色见表3和图3,4。

图1 4组大鼠肝组织HE染色(×200)A.正常对照组;B.模型组;C.TFL小剂量组;D.TFL大剂量组Fig.1 HE staining on liver tissue of 4 groups of rats(×200)A.normal control group,B.model group,C.low-dose TFL group,D.high-dose TFL group

图2 4组大鼠肝组织Masson染色(×100)A.正常对照组;B.模型组;C.TFL小剂量组;D.TFL大剂量组Fig.2 Masson staining on liver tissue of 4 groups of rats(×100)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

表3 4组大鼠肝组织TLR4与NF-κB免疫组化评分结果Tab.3 Results of TLR4、NF-κB expressions in liver tissue by immunohistochemical staining 分,±s

表3 4组大鼠肝组织TLR4与NF-κB免疫组化评分结果Tab.3 Results of TLR4、NF-κB expressions in liver tissue by immunohistochemical staining 分,±s

与模型组比较,*1P＜0.01Compared with model group,*1P＜0.01

组别大鼠/只TLR4NF-κB TFL小剂量组163.1±0.54.68±0.70大剂量组191.4±0.5*13.47±0.61*1模型组163.3±0.65.12±0.89正常对照组200.4±0.50.80±0.77

3 讨论

本研究采用胆总管结扎法复制类似人胆汁淤积性肝纤维化的大鼠模型,该模型具有操作简便、重现性好、造模时间短等优点。本研究结果表明模型组全部大鼠肝脏组织肝小叶结构及肝细胞索排列紊乱,大量肝细胞坏死,肝实质内及胆管周围可见不同程度的胶原沉积,汇管区、汇管区之间、汇管区与中央静脉之间小胆管弥漫性增生,部分可见假小叶形成,提示模型复制成功。采用大剂量TFL干预后,大鼠肝纤维化程度减轻,汇管区增生明显缩小,偶见点、灶状坏死,纤维组织增生减少,肝小叶结构趋于正常,而TFL小剂量组在肝组织病理学变化、减少肝组织胶原沉积上与模型组比较均差异无统计学意义。说明大剂量TFL对胆汁淤积性肝纤维化大鼠有显著的治疗作用。本实验免疫组化结果显示,模型组大鼠TLR4、NF-κB的表达明显升高,而TFL大剂量组表达较低,组间差异有统计学意义,说明TLR4的过度表达可能激活细胞内NF-κB通路,参与了肝纤维化的发生和发展,而大剂量TFL对其表达有一定抑制作用。其机制可能为胆总管结扎术后大鼠出现梗阻性黄疽,会导致肠道屏障功能下降,库否细胞功能受损,细菌位移入血,细菌及其产物造成的毒血症,导致肠源性内毒素血症发生,诱导了肝组织内TLR4的高表达,引起下游传导信号NF-κB的活化和核内转移。大剂量TFL可下调肝组织内TLR4的表达,有效抑制NF-κB的激活,减少了免疫反应与炎症反应的细胞因子表达所致的HSC的活化增殖,发挥抗肝纤维化作用[13-19]。

图3 4组大鼠肝组织TLR4蛋白免疫组织化学染色(SP法×400)A.正常对照组;B.模型组;C.TFL小剂量组;D.TFL大剂量组Fig.3 Immunohistochemical staining on TLR4 protein in liver tissue of 4 groups of rats(SP×400)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

图4 4组大鼠肝组织NF-κB免疫组织化学染色(SP法×400)A.正常对照组;B.模型组;C.TFL小剂量组;D.TFL大剂量组Fig.4 Immunohistochemical staining on NF-κB in liver tissue of 4 groups of rats(SP×400)A.normal control group;B.model group;C.low-dose TFL group;D.high-dose TFL group

综上所述,随着肝纤维化程度的加重,TLR4、NF-κB在大鼠肝纤维化组织细胞膜、细胞质、细胞核中表达均明显增加,而大剂量TFL可能通过降低肝组织中TLR4、NF-κB的表达而发挥抗肝纤维化的作用。这为抗肝纤维化的新药开发及TLR4/NF-κB信号通路的理论研究提供了新的方向。

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DOI 10.3870/yydb.2014.03.004

Effect of Total Flavone from Litchi chinensis Sonn on the Expression of TLR4 and NF-κB in Livers of Rats with Hepatic Fibrosis

HE Zhi-guo1,ZHAO Yong-zhong1,LU Qing1,ZHOU Ying-qiong2,XIAO Xu-hua1,HOU Qiao-yan2, HUANG Da-jian1,CHENG Qiu-chen1
(1.Department of Gastroenterology;2.Department of Pathology,the Affiliated Hospital of Guilin Medical College,Guilin 541004,China)

Objective To investigate the effects of total flavone ofLitchi chinensisSonn(TFL)on TLR4 and NF-κB expression in the livers of rats with hepatic fibrosis.MethodsEighty male SD rats were randomly divided into four groups:normal control,model control,TFL at low-dose(100 mg·kg-1·d-1)and high-dose(200 mg·kg-1·d-1).The model of liver fibrosis in rats was induced by ligating common bile duct(CBDL)for all rats except for the normal controls.The rats were treated with TFL and 0.9%physiological saline in the tested,the normal and model groups,respectively once a day for 4 weeks.All rats were sacrificed in the end,and the livers were collected for histopathological studied by hematoxylin-eosin(H&E)staining and Masson Trichrome(MT)examination.The expressions of TLR4 and NF-κB in livers of above four groups were detected by immune-histologic chemistry(IHC).ResultsCompared with the model group,significantly milder liver fibrosis and lower collagen expression were found in the high-dose of TFL treated group(P＜0.01).The score of TLR4 expression in the normal and model groups,TFL at low-dose and high-dose was(0.4±0.5),(3.3±0.6),(3.1±0.5),(1.4±0.5),and that of NF-κB was (0.80±0.77),(5.12±0.89),(4.68±0.70),and(3.47±0.61),respectively.The protein expression of TLR4 and NF-κB in the model group was significantly higher than that in the normal control and TFL high-dose group(P＜0.01),but had no obvious difference from the lower dose group.ConclusionHigher expression of TLR4 and NF-κB may be involved in the liver fibrogenisis and development by CBDL in rats.TFL at high-dose may improve liver fibrosis induced by CBDL via inhibiting the expression of TLR4 and NF-κB in hepatic tissue in rats.

Total flavone ofLitchi chinensisSonn;Hepatic fibrosis;Toll-like receptor 4;NF-κB

R286;R965

A

1004-0781(2014)03-0286-05

2013-05-10

2013-06-20

*广西壮族自治区自然科学基金项目(2012GXNSFAA053105);广西壮族自治区教育厅科研资助项目(201012MS172);国家自然科学基金资助项目(81360659)

何志国(1978-),男,湖北随州人,主治医师,硕士,主要从事消化内科专业工作。E-mail：hezhiguo429001@21cn.com。

赵永忠(1968-),男,广西桂林人,主任医师,教授,硕士生导师,研究方向:慢性肝病的基础与临床。E-mail：zyz-1968@163.com。