双黄连联用左氧氟沙星对兔组织笼感染模型中金黄色葡萄球菌ATCC29213耐药性的影响*

王国俊,叶云,冯碧敏,李虹

(泸州医学院 1.附属医院药剂科;2.药学院,泸州 646000)

双黄连联用左氧氟沙星对兔组织笼感染模型中金黄色葡萄球菌ATCC29213耐药性的影响*

王国俊1,叶云1,冯碧敏1,李虹2

(泸州医学院 1.附属医院药剂科;2.药学院,泸州 646000)

目的 探讨双黄连联合左氧氟沙星对兔组织笼感染模型中金黄色葡萄球菌ATCC29213对左氧氟沙星的耐药性的影响。方法建立兔组织笼感染模型,分别用左氧氟沙星单独处理(A组)及双黄连联合左氧氟沙星处理(B组)5 d,探讨兔组织笼感染模型中左氧氟沙星在组织液中稳态浓度及经处理后兔组织笼中细菌恢复生长的情况和细菌耐药性变化。结果两组左氧氟沙星在组织液中浓度差异无统计学意义。B组兔组织笼内细菌恢复生长发生率(20%)明显低于A组(100.0%),而左氧氟沙星对B组兔组织笼内细菌的最低抑菌浓度(MIC)值明显低于A组。结论双黄连与左氧氟沙星联合治疗有助于减少金黄色葡萄球菌对左氧氟沙星的耐药现象,提示中药联合抗菌药物可降低细菌对抗菌药物的耐药性。

双黄连;左氧氟沙星;金黄色葡萄球菌;耐药性;模型,兔组织笼感染

细菌等病原微生物感染一直是威胁人类健康的重要疾病之一。左氧氟沙星(levofloxacin,LVLX)为氟喹诺酮类抗菌药物,具有广谱、高效的抗菌活性,临床应用广泛。然而近年来细菌对氟喹诺酮类药物的耐药现象日益严重。由于自然界中存在的天然耐药菌只占少数,难以与占大多数的优势敏感菌竞争,只有敏感菌因抗菌药物的选择作用而被大量杀灭后,耐药菌才能大量繁殖成为优势菌而产生耐药。耐药突变选择窗(mutant selection window,MSW)是最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)与防耐药变异浓度(mutant prevention concent ration,MPC)之间的浓度范围,在此范围内,耐药菌株可以被选择性富集。MSW越宽,越容易出现耐药菌株;反之,MSW越窄,产生耐药菌株的可能性越小。MPC提供了抗菌药物治疗中严格限制突变菌株被选择性扩增的抗菌药物浓度阈值,药物浓度高于该阈值可有效避免耐药菌株的选择性富集。对于多数氟喹诺酮类药物包括左氧氟沙星,其MPC远大于MIC,要获得血清或组织药物浓度超过MPC很困难[1-2],因此容易导致细菌耐药性产生。

研究表明即使药物各自都有非常高的MPC,不同作用机制的抗菌药物联合应用也可缩小或关闭MSW,从而有效的延缓细菌耐药性的产生[3]。但中药与抗菌药物联合应用对于细菌MSW的作用笔者鲜见报道。笔者通过体外研究发现双黄连和左氧氟沙星联合用药有同上述研究结论一致的结果,可使左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌(金葡菌)ATCC29213的MSW缩小[4],提示二者联用有利于减少细菌耐药性产生。但二者联用的体内研究笔者尚未见报道。笔者通过建立兔组织笼感染模型,考察双黄连粉针与左氧氟沙星联合应用对金葡菌ATCC29213耐药性的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 普通级成年健康家兔,雌雄各半,体质量2.5～3.0 kg,由泸州医学院实验动物中心提供,许可证号:SYXK(川)2008-065,合格证号:川医动2401115。

1.2 试药 双黄连粉针(哈药集团中药二厂生产,规格:每支600 mg,批号:1003015);盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液(扬子江药业集团有限公司生产,规格: 0.3 g∶100 mL,批号:11061631);注射用青霉素钠(华北制药厂生产,规格:80万U,批号:09013025);3%戊巴比妥钠(湖北远成药业有限公司生产,规格:每支0.1 g,批号:YC10000);左氧氟沙星标准品(中国食品药品检定研究院,批号:130455-201005,纯度: 97.3%);加替沙星(中国食品药品检定研究院,批号: 130518-200402,纯度:97.2%);Mueller.Hinton(MH)肉汤、MH琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司,批号: 100804);乙腈为色谱纯;磷酸二氢钾为分析纯。

1.3 实验器材 离心机(长沙英泰仪器有限公司,型号:A130102);涡旋混合器(杭州赛智科技有限公司,型号:ST-0246);高效液相色谱仪(型号:UltiMate 3000,戴安,二极管阵列检测器),色谱柱:Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);二氧化碳(CO2)培养箱(上海一恒科技有限公司,型号:HH.CP-01);无菌的多孔、中空的高尔夫练习球(直径43 mm)。

1.4 菌株 金葡菌ATCC29213,中国食品药品检定研究院提供。

1.5 左氧氟沙星对金葡菌ATCC29213的MIC、MPC测定 采用琼脂平板稀释法,具体见笔者以前的报道[4]。

1.6 兔组织笼感染模型的建立 成年健康家兔15只,背部去毛,3%戊巴比妥钠麻醉,皮肤聚维酮碘消毒,皮下植入高尔夫练习球1个。2周后手术伤口愈合,4周后,高尔夫练习球内已充满清亮的组织液,实验前一天,用无菌注射器抽取球内液体0.5 mL,取100 μL接种于MH琼脂平板上,37℃过夜培养,经检验无菌后,用于建立感染模型。用无菌注射器往高尔夫练习球内注入1.2×1010CFU对数生长期金葡菌ATCC29213。2 d后抽取球内组织液0.5 mL进行细菌菌落计数,细菌浓度在1×108CFU·mL-1以上者用于实验(经测定,15只兔组织液中细菌数目全部符合要求)。感染3 d后开始分组处理[5]。

1.7 给药方法 15只实验动物随机分为3组,每组各5只。A组:单独给予左氧氟沙星8 mg·kg-1·d-1; B组:给予注射左氧氟沙星8 mg·kg-1·d-1后再给予双黄连粉针92 mg·kg-1·d-1;阴性对照组:给予相应量的0.9%氯化钠溶液。均为耳缘静脉注射,连续给药5 d[6]。

1.8 兔组织笼感染模型中感染部位左氧氟沙星浓度测定 第5天给药后2,4,6,8,10 h末取组织液0.35 mL,加入4 μg·mL-1内标加替沙星50 μL,15%高氯酸蛋白沉淀剂100 μL,涡旋振荡1 min, 12 000 r·min-1离心10 min,吸取上清液,采用高效液相色谱法测定组织液中左氧氟沙星浓度。色谱条件: Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为0.05 mol·L-1磷酸二氢钾∶乙腈(80∶20),用磷酸调至pH4.5,流速1 mL·min-1,紫外检测波长294 nm,柱温30℃,进样量20 μL[7]。

1.9 兔组织笼感染模型中金葡菌MIC测定 上述各组处理结束后48 h抽取组织笼中组织液20 μL,置于培养基中,37℃增菌,观察细菌恢复生长的情况,对恢复生长细菌按美国临床实验室标准化委员会推荐的标准测定其左氧氟沙星的MIC。

1.10 统计学方法 不同处理组药物浓度及金葡菌的MIC比较采用两个样本均数比较的t检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体外测定 左氧氟沙星对金葡菌的MIC为0.13 μg·mL-1,MPC为1.30 μg·mL-1,其MSW为0. 13～1.30 μg·mL-1。

2.2 不同时间兔组织笼感染模型组织液中左氧氟沙星的浓度 由表1可知:A组与B组在给药10 h后组织液中左氧氟沙星的浓度开始低于0.13 μg·mL-1,在给药2 h至给药8 h后,兔组织液中的左氧氟沙星均略大于0.13 μg·mL-1,兔组织液中左氧氟沙星浓度至少有25%时间处于其MSW(0.13～1.30 μg·mL-1)内的,其tmsw(tmsw:药物浓度在MSW内的时间)＞25%。经统计学检验表明A组与B组左氧氟沙星组织液浓度差异无统计学意义(P＞0.05)。表明兔组织液中金葡菌耐药情况的差异并非由于左氧氟沙星浓度差异所致。

表1 不同时间点两组兔组织液中左氧氟沙星的浓度Tab.1 Levofloxacin concentration in two groups of rabbit tissue fluid at different time points μg·mL-1,±s

表1 不同时间点两组兔组织液中左氧氟沙星的浓度Tab.1 Levofloxacin concentration in two groups of rabbit tissue fluid at different time points μg·mL-1,±s

组别家兔/只组织液中左氧氟沙星浓度2 h4 h6 h8 h10 h A组50.193±0.0610.180±0.0280.174±0.0260.186±0.0290.092±0.016 B组50.185±0.0450.152±0.0190.169±0.0250.160±0.0250.093±0.024

2.3 不同治疗组兔组织笼内细菌恢复生长比率 阴性对照组5只家兔组织液抽取培养后均有细菌生长,A组单用左氧氟沙星处理的5只家兔组织笼内细菌在处理结束后均恢复生长,而B组双黄连联用左氧氟沙星处理的5只家兔仅出现了1例细菌恢复生长。单用左氧氟沙星处理的家兔细菌恢复生长发生率(100.0%)明显高于双黄连联用左氧氟沙星处理后的家兔细菌恢复生长率(20.0%)。

2.4 兔组织笼内细菌的耐药性变化 A组5只家兔组织液中恢复生长的细菌左氧氟沙星对其的MIC均有明显升高,MIC为(0.73±0.29)μg·mL-1;B组仅有1只兔中组织液有细菌恢复生长,升高为原金葡菌ATCC29213的2MIC,其余4只家兔组织笼内未出现细菌恢复生长。将被杀死的金葡菌MIC计为原金葡菌ATCC29213的MIC(0.13 μg·mL-1),得MIC为(0.16±0.06)μg·mL-1。A组的恢复生长细菌左氧氟沙星MIC显著高于B组MIC(P＜0.05)。

3 讨论

模拟研究人体的兔组织笼模型常用于测定药物的组织分布等研究,运用感染性家兔模型进行药物动力学研究,可观察药物在特定感染组织中的药效学,也可用于抗菌药物间在感染条件下的疗效比较[8],因此本文建立兔组织笼感染模型用于研究家兔感染部位组织液中药物浓度。

FIRSOV等[9]研究表明,当氟喹诺酮药物tmsw＞20%治疗时间时,金葡菌的耐药突变菌株容易被选择性富集扩增,从而导致MIC提高。当tmsw≤20%治疗时间时,MIC无变化。药物浓度在MSW的不同位置,对出现耐药的时间及耐药程度均具有明显的影响。且药物浓度在MSW的下部时,更容易选择出耐药突变菌株。本实验中A组与B组兔组织液中左氧氟沙星的tmsw＞20%,均位于MSW的下部且两组家兔组织液中左氧氟沙星浓度差异无统计学意义。表明两组中左氧氟沙星均处于容易选择出耐药突变菌株的浓度,且兔组织液中金葡菌耐药情况的差异并非由于左氧氟沙星浓度差异所致。

MSW理论认为当两种不同作用机制的药物联合用药,并同时处于各自的MIC之上时,病原菌必须同时发生两种耐药突变才能生长,因此即使这些药物各自都有非常高的MPC,也不会产生耐药突变。上述兔组织笼感染模型单用左氧氟沙星组(A组)停止给药后出现了5例细菌恢复生长,而双黄连联用左氧氟沙星组(B组)仅出现了1例细菌恢复生长。测定各组组织液中恢复生长的金黄色葡萄球菌MIC可知,双黄连联用左氧氟沙星组细菌MIC与单用左氧氟沙星组细菌MIC比较差异有统计学意义(P＜0.05)。提示单用左氧氟沙星治疗感染,药物浓度在MSW内易诱导细菌出现耐药,而具有抗菌作用的中药与左氧氟沙星联用有助于提高治疗效果并减少细菌对左氧氟沙星的耐药现象,但由于动物体内研究具有一定的局限性,上述结论尚需更深入研究及临床加以验证。

[1] DRLICA K,MALIK M.Fluoroquionones:action and resistance[J].Current Topics Med Chem,2003,3(3):249-282.

[2] 李朝霞,刘又宁,王睿,等.氟喹诺酮类药物对金黄色葡萄球菌及其耐药突变体的耐药性研究[J].中国临床药理学与治疗学,2006,11(6):696-701.

[3] DRLICA K.The mutant selection window and antimicrobial resistance[J].J Antimicrob Chemother,2003,52(1):11-17.

[4] 王国俊,叶云,李虹.中药影响左氧氟沙星对金黄色葡萄球菌的耐药突变选择窗MSW的初步研究[J].中国药房, 2012,23(39):3659-3661.

[5] 崔俊昌,刘又宁,王睿.耐药突变选择窗与细菌耐药的动物体内研究[J].中华老年多器官疾病杂志,2007,6(5): 339-346.

[6] 周志凌,余细勇,杨敏,等.左氧氟沙星分散片人体相对生物利用度及生物等效性研究[J].中国现代应用药学, 2008,25(3):220-223.

[7] 王国俊,叶云,龙恩武,等.左氧氟沙星单用及联用双黄连后兔组织液中的浓度差异[J].华西药学杂志,2013,28 (3):269-271.

[8] FERNAND Z J,BARRETT J F,LICATA L,et al.Comparisonof efficacies of levofloxacin and oral ciprofloxacin in a rabbit model of a staphylococcal abscess[J].Antimicrob A Gents Chemother,1999,43(3):667-671.

[9] FIRSOV A A,VOSTROV S N,LUBENKO I Y,et al.In vitropharmacodynamic evaluation of the mutant selection window hypothesis using four fluoroquinolones against staphylococcus aureus[J].Antimicrob Agents Chemother,2003,47(5): 1604-1613.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.006

Effect of Shuanghuanglian Combined with Levofloxacin on Antibiotic Resistance of Staphylococcus Aureus ATCC29213 in Rabbit Tissue Cage Infection Model

WANG Guo-jun1,YE Yun1,FENG Bi-min1,LI Hong2
(1.Department of Pharmacy,the Affiliated Hospital;2. the Pharmaceutical School,Luzhou Medical College,Luzhou 646000,China)

Objective To explore effects ofshuanghuangliancombined with levofloxacin on antibiotic resistance ofStaphylococcus AureusATCC29213 to levofloxacin.MethodsTissue cage infection model withStaphylococcus aureuswas established in rabbits,and the infected animals were given with levofloxacin alone(group A)or in combination withshuanghuanglian(group B)for 5 days respectively.Steady-state concentration of levofloxacin in tissue cage,bacteria recovery and bacterial resistance in tissue cage infection model were studied.ResultsSteady-state concentration of levofloxacin in tissue cage was not significantly different between group A and group B.The recovery rate of bacteria was significantly lower in group B than in group A(20.0%vs.100.0%).The minimum inhibitory concentration(MIC)was lower in group B than in group A.ConclusionShuanghuangliancombined with levofloxacin is helpful to reduce antibiotic resistance ofStaphylococcus aureusto levofloxacin,indicating that some Chinese traditional medicine combined with antibiotics can reduce antibiotic resistance.

Shuanghuanglian;Levofloxacin;Staphylococcus aureus;Antibiotic resistance;Model,rabbit tissue cage infection

R286;R285.5

A

1004-0781(2014)08-1001-04

2013-03-27

2014-01-10

*杨森科学研究委员会中国分会研究基金资助项目(JRCC2011药理02);泸州医学院青年基金资助项目(泸医院科[2009]1号)

王国俊(1975-),女,四川泸州人,副主任药师,硕士,研究方向:临床药学。电话:0830-3165750,E-mail: wanggj7532@163.com。

叶云(1963-),男,四川泸州人,教授,学士,研究方向:临床药学。电话:0830-3165750,E-mail:yeyun8622@ 163.com。