液相色谱-串联质谱法测定人全血兰地洛尔浓度*

俞蕴莉,张全英,华雯妍,黄明,王蒙

(苏州大学附属第二医院临床药理实验室,苏州 215004)

·心血管疾病用药专栏·

液相色谱-串联质谱法测定人全血兰地洛尔浓度*

俞蕴莉,张全英,华雯妍,黄明,王蒙

(苏州大学附属第二医院临床药理实验室,苏州 215004)

目的 采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法测定全血兰地洛尔的浓度,为注射用盐酸兰地洛尔的人体药动学研究提供检测手段。方法全血样本加入甲硫酸新斯的明后经乙腈沉淀蛋白,采用WATERS公司XTerra®RP18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱,以乙腈∶10 mmol·L-1醋酸铵缓冲液(含0.1%甲酸)=36∶64(V/V)为流动相,流速为1 mL·min-1;质谱采用电喷雾离子化,正离子-多反应监测模式对兰地洛尔(m/z510.5→423.1)和内标文拉法辛(m/z278.2→215.1)的浓度进行测定。结果兰地洛尔的全血浓度在1.010～2 020 μg·L-1范围内线性良好,定量下限为1.010 μg·L-1,批内精密度RSD＜6.5%,批间精密度RSD＜4.8%,提取回收率为92.6%～100.9%。结论该样品处理方法简便,测定方法灵敏、准确,适用于注射用盐酸兰地洛尔的人体药动学研究。

兰地洛尔;血药浓度;液相色谱-串联质谱法

盐酸兰地洛尔(landiolol hydrochloride)是由日本小野制药工业株式会社研制开发的新型超短效β1受体阻断药,其适应证主要包括:①手术时心动过速性心律不齐的紧急处置(心房纤维颤动、心房扑动和窦性心动过速);②手术后循环动态监控下,心动过速性心律不齐的紧急处置(心房纤维颤动、心房扑动和窦性心动过速)。盐酸兰地洛尔在日本已被广泛用于围手术期各种原因导致的快速型心律失常的控制。兰地洛尔是在艾司洛尔的化学结构基础上改造而得的新化合物。与艾司洛尔相比,兰地洛尔对受体的选择性更高,起效更快,消除更快,用量更少[1]。同时,兰地洛尔还具有心脏抑制作用轻等优点。兰地洛尔在中国人体内的药动学研究笔者未见报道,了解兰地洛尔在中国人群中的药动学特征,有助于制定更为合理有效的临床用药方案。笔者旨在通过灵敏、准确、高效的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法建立测定人全血兰地洛尔浓度的方法,为注射用盐酸兰地洛尔的人体药动学研究提供检测手段。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LC-MS/MS系统:API-4000型三重四极杆串联质谱仪(美国Applied Biosystem Sciex公司), Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。数据处理系统为Analyst 1.4.2。

1.2 试药 盐酸兰地洛尔对照品(重庆鼎联制药有限公司,批号:T21-0907001,含量:100%);盐酸文拉法辛(内标)对照品(重庆医药工业研究院有限责任公司,批号:05011901,含量:99.3%)。甲硫酸新斯的明(Sigma-Aldrich公司,批号:BCBD8573V);乙腈(色谱纯,美国TEDIA公司);甲酸(色谱纯,美国TEDIA公司);醋酸铵(分析纯,国药集团化学试剂有限公司);水为灭菌注射用水(安徽双鹤药业有限责任公司);空白人全血(本院血库提供)。

2 方法与结果

2.1 色谱与质谱条件 色谱柱:WATERS公司XTerra®RP18(150 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱, Phenomenex Security GuardTMC18预柱;流动相:乙腈∶10 mmol·L-1醋酸铵缓冲液(含0.1%甲酸)=36∶64 (V/V)组成;流速为1 mL·min-1;进样体积为10 μL;每个样品的分析时间为3.5 min。多反应离子监测,电喷雾离子源,正离子,测定兰地洛尔和内标的检测离子分别为:m/z510.5→423.1和m/z278.2→215.1。质谱参数:碰撞气(CAD)8 psi,帘气(CUR)15 psi,雾化气(Gas1)55 psi,辅助气(Gas2)40 psi,喷雾电压(IS) 3 500 V,雾化温度(TEM)600℃。

2.2 溶液的制备 兰地洛尔标准曲线工作液:精密称取盐酸兰地洛尔对照品10.80 mg(相当于兰地洛尔10.10 mg),置10 mL量瓶中,加入乙腈定容至刻度,混匀得到1.010 mg·mL-1的兰地洛尔标准曲线储备液,以乙腈为溶剂,定量稀释配制成0.010 10,0.030 30, 0.101 0,0.303 0,1.010,3.030,10.10,20.20 μg·mL-1的系列标准曲线工作液。兰地洛尔质控工作液:精密称取盐酸兰地洛尔对照品10.80 mg(相当于兰地洛尔10.10 mg),置10 mL量瓶中,加入乙腈定容至刻度,混匀得到1.010 mg·mL-1的兰地洛尔质控储备液,以乙腈为溶剂,定量稀释配制成0.020 20,0.505 0,16.16 μg·mL-1的质控工作液。文拉法辛(内标)工作液:精确称取对照品盐酸文拉法辛10.00 mg(含文拉法辛8.780 mg),置10 mL量瓶中,加注射用水定容至刻度,混匀得0.878 0 mg·mL-1的文拉法辛储备液,以注射用水为溶剂,定量稀释配制成87.80 μg·L-1的工作液。2 mg·mL-1甲硫酸新斯的明溶液的配制:精确称取甲硫酸新斯的明100 mg,置50 mL量瓶中,加水定容,混匀得2 mg·mL-1的甲硫酸新斯的明溶液。

2.3 全血样本处理 在新鲜空白全血1 mL中,加入2 mg·mL-1的甲硫酸新斯的明溶液25 μL,混匀备用。空白全血每次使用前制备,制备后1 h内用完。精密吸取含有甲硫酸新斯的明的全血样本200 μL至 1.5 mL塑料离心管中,加入内标工作液50 μL,混匀,加入乙腈600 μL,涡旋1 min,于16 000 r·min-1、4℃离心8 min。取上清液100 μL加入注射用水100 μL,涡旋30 s混匀,进样10 μL。

2.4 方法特异性考察 空白全血、兰地洛尔和内标文拉法辛对照品混合液及受试者服药后的全血样本进行色谱分析。结果显示:兰地洛尔和内标文拉法辛保留时间约为2.17和2.27 min,内源性物质对测定无干扰。说明本方法具有较高的特异性,能准确测定全血中的兰地洛尔。

2.6 精密度和准确度 精密吸取空白全血180 μL,分别加入兰地洛尔质控工作液20 μL,制备含兰地洛尔浓度分别为2.02,50.50,1 616 μg·L-1的标准含药全血,每个浓度平行配制5份,按“2.3”项下操作并测定。每天一批,连续测定3批,每批随行一条标准曲线。记录色谱图、兰地洛尔峰面积As和内标峰面积Ai。计算As和Ai的比值f(f=As/Ai),将f值代入随行标准曲线求得实测浓度。用Excel软件单因素方差分析统计批内和批间精密度,同时计算相对偏差,结果见表1。

表1 全血中兰地洛尔批内、批间精密度Tab.1 Inter-and intro-precision of landiolol in human blood ±s,n=15

表1 全血中兰地洛尔批内、批间精密度Tab.1 Inter-and intro-precision of landiolol in human blood ±s,n=15

加入浓度测得浓度(μg·L-1)批内RSD批间RSD准确度RE % 2.02 2.17±0.146.54.87.2 50.50 52.20±2.004.02.13.3 1 616.001 597.00±70.004.80.3-1.2

2.9 稳定性实验 分别考察兰地洛尔低、中、高浓度(2.020,50.50,1 616 μg·L-1)的标准含药全血样本于室温放置1 h、待测样品自动进样器放置24 h,处理后上清液室温放置6 h、-70℃反复冻融3次及-70℃保存至14 d条件下的稳定性。以不同放置条件下样品的实测值与加入值相比计算偏差。结果兰地洛尔标准含药全血样本于室温放置1 h测定浓度相对误差分别为4.5%,-5.2%和-11.5%;待测样品于自动进样器放置24 h后,测定浓度RE分别为10.9%,4.7%和-3.9%;上清液样品于室温放置6 h的测定浓度RE分别为7.1%,6.8%和3.1%;-70℃反复冻融3次后的测定浓度RE分别为-6.1%,-0.7%和-10.5%; -70℃放置14 d的测定浓度计算RE分别为5.0%, -1.3%和-9.4%。提示,本试验所有样品在上述条件下均稳定。储备液于2～8℃以及-40℃放置11 d后的实测浓度计算RE为-0.2%和-0.6%,提示,储备液在2～8℃以及-40℃放置11 d后仍稳定。

2.10 样本的测定 1例健康受试者参加注射用盐酸兰地洛尔单次给药人体药动学预试验。以125 μg·kg-1·min-1急速静脉注射1 min后,以20 μg·kg-1·min-1静脉内持续给药60 min。于急速静脉注射给药前(0 min)和急速给药开始后1 min,以及静脉内持续给药开始后1,2,5,10,15,30,60 min和持续给药结束后2,5,10,15,20,40 min由肘静脉采血2 mL,置装有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic aicd,EDTA)和甲硫酸新斯的明的真空采血管中,直接用冰浴冷却,立即按“2.3”项下操作并测定全血中兰地洛尔的浓度。受试者全血药物浓度-时间曲线见图1。

3 讨论

本实验主要目的是为注射用盐酸兰地洛尔的人体药动学研究提供血药浓度检测方法。由于兰地洛尔结构中有一个酯键,能够被血中酯酶迅速水解为无活性的代谢产物,在血样前处理中,采用在全血中加入胆碱酯酶抑制药甲硫酸新斯的明抑制兰地洛尔的降解[2-3]。本实验考察了不同浓度(2,5 μg·mL-1和0.02,0.1,0.5, 2 mg·mL-1)甲硫酸新斯的明处理全血样本,在室温放置不同时间(立即处理,放置0.5及1 h)下,抑制兰地洛尔水解的作用。通过比较样本的质谱响应值发现,1 mL全血样本中加入2 mg·mL-1甲硫酸新斯的明溶液25 μL能够保证全血中兰地洛尔在室温放置1 h内稳定。

图1 兰地洛尔的全血浓度-时间曲线图Fig.1 Blood concentration-time profiles of landiolol

目前文献报道的兰地洛尔血药浓度测定方法有高效液相色谱法[4]、LC-MS/MS[5]方法,样品处理方法为固相萃取[4]和液-液萃取[5]。笔者建立的LC-MS/MS法测定人全血中兰地洛尔浓度,以乙腈直接沉淀蛋白为样品预处理方法,较文献报道方法简便、低耗,具有更高的分析效率,可成功地应用于盐酸兰地洛尔的人体药动学研究。

[1] 赫冠男,吕黄伟,王俊科.兰地洛尔的药理作用及其围手术期的应用[J].中国新药与临床杂志,2007,26(12): 942-945.

[2] 马巧灵,刘秀民.新斯的明穴位封闭治疗下肢骨折腹胀患者疗效观察[J].护理学杂志,2006,21(18):48-49.

[3] 李爱萍,郭兆宁.阿托品联合新斯的明缓解留置尿管致术后尿道不适效果观察[J].护理学杂志,2005,20(24): 57-58.

[4] SUNO M,KUNISAWA T,YAMAGISHI A,et al.Detection of landiolol using high-performance liquid chromatography/ fluorescence:a blood esterase-sensitive ultra-short-acting beta(1)-receptor antagonist[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2009,877(16-17):1705-1708.

[5] HE Q,SHI M,LIU X,et al.Determination of landiolol,an ultra-short-acting β-receptor antagonist,in human plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2012,891-892:7-11.

DOI 10.3870/yydb.2014.08.008

Determination of Landiolol Concentration in Human Blood by LC-MS/MS

YU Yun-li,ZHANG Quan-ying,HUA Wen-yan,HUANG Ming,WANG Meng
(Department of Clinical Pharmacology,the Second Affiliated Hospital of Soochow University,Suzhou 215004,China)

Objective To establish an LC-MS/MS method for the detection of landiolol concentration in human blood.MethodsAfter pretreatment with neostigmine and a deproteinization procedure,landiolol and the internal standard venlafaxine were eluted isocratically using a mobile phase consisting of acetonitrile and 10 mmoL·L-1ammonium acetate with 0.1%formic acid in a ratio of 36∶64(V/V).Separation of the respective compounds was achieved on a Waters XTerra®RP18column (150 mm×4.6 mm,5 μm).Quantitative analysis of landiolol was conducted by a triple-quadrupole mass spectrometer with positiveelectrospray ionization source,monitored under a multiple reaction monitoring(MRM)mode.The extracted ions monitored following MRM transitions werem/z510.5→423.1 for landiolol andm/z278.2→215.1 for the internal standard venlafaxine.ResultsThe calibration curve of landiolol in human blood showed good linear relationship in the range of 1.010-2 020 μg·L-1.The lower limit of quantitation was 1.010 μg·L-1.The RSD of within-day and between-day precision was less than 6.5%and 4.8%, respectively.The recovery rate was 92.6%-100.9%.ConclusionThe method is proven to be simple,rapid and reliable,and can be applied to study the pharmacokinetics of landiolol hydrochloride in healthy Chinese volunteers.

Landiolol;Drug concentration of blood;LC-MS/MS

R972.2;R969.1

A

1004-0781(2014)08-1009-04

2013-08-21

2014-01-17

*江苏省中医药局科技项目(LZ13159)

俞蕴莉(1982-),女,江苏苏州人,主管药师,博士,研究方向:药代动力学。电话:0512-67783687,E-mail: chrisyu1255@aliyun.com。

张全英(1962-),女,江苏苏州人,主任药师,学士,研究方向:临床药学。电话:0512-67783681,E-mail: sdfeyyq@163.com。