五种医院制剂微生物限度检查方法验证

杨育林，吉莹洁

(洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471023)



五种医院制剂微生物限度检查方法验证

杨育林，吉莹洁

(洛阳市食品药品检验所，河南 洛阳 471023)

目的：建立五种医院制剂微生物限度检查方法。方法：采用常规法、薄膜过滤法对五种医院制剂进行方法验证。结果：椎间盘丸、顽痹康丸、芪仲腰舒丸可采用常规法，颈痛消丸、骨炎托毒丸须用薄膜过滤法除去其抑菌作用后方可进行微生物限度检查。结论：确立了五种医院制剂微生物限度检查方法，可有效控制其质量。

医院制剂；微生物限度检查；方法验证

微生物限度是药品安全性的重要指标之一，1995年版《中国药典》 首次收载微生物限度检查法，此后的三版药典均对其进行了较大幅度的修订、增订，为其结果的可靠性提供了保障。然而现行的各类药品标准所收载的各中药制剂品种检查项下，很少规定具体的微生物限度检查方法，这就要求我们对所采用的检测方法进行验证试验，确保该方法的可靠性。椎间盘丸、顽痹康丸、芪仲腰舒丸、颈痛消丸、骨炎托毒丸是河南省洛阳正骨医院临床使用广泛的五种中药制剂，本文参考有关资料[1-5]，对其微生物限度检查方法进行考察，为以后检验提供参考依据。

1 材料

1.1 供试品

椎间盘丸(批号：20130604)、顽痹康丸(批号：20130203)、芪仲腰舒丸(批号：20130104)、颈痛消丸(批号：20130106)、骨炎托毒丸(批号：20130602)，均为河南省洛阳正骨医院生产。

1.2 菌种

大肠埃希菌(CMCC(B) 44 102)、金黄色葡萄球菌(CMCC(B) 26 003)、枯草芽孢杆菌(CMCC(B) 63 501)、白色念珠菌(CMCC(F) 98 001)、黑曲霉菌(CMCC(F) 98 003)均由河南省食品药品检验所提供。

1.3 培养基与稀释液

营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基、营养肉汤培养基、胆盐乳糖培养基均由北京三药科技开发公司生产；0.9%无菌氯化钠溶液、pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液由本所配制。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌与枯草芽孢杆菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基中，35℃培养18～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成50～100cfu/mL的菌悬液。接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，25℃培养24～48h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成50～100cfu/mL的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，25℃培养1周，加入3～5mL含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸出孢子菌液至灭菌试管内，用含0.05%(mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成50～100cfu/mL的孢子悬液。

2.2 供试液制备

取供试品10g，加pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100mL，制成1∶10的供试液。

2.3 细菌、霉菌及酵母菌计数方法验证

2.3.1 试验组 常规法：取1∶10供试液1mL，分别人工接种50～100cfu上述5种阳性试验菌株，立即倾注15～20mL琼脂培养基，平行制备2个平皿，待凝固后置规定温度培养至规定时间，观察结果。薄膜过滤法：取1∶10供试液10mL， 以500r/min离心3min，取1mL上清液加入薄膜过滤器中，过滤后用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300mL分3次冲洗。在最后一次冲洗液中加入50～100cfu试验菌株，滤干，取出薄膜贴于琼脂培养基上，规定温度培养至规定时间，观察结果。

2.3.2 菌液组 按试验组各方法不加供试液操作，测定所加菌数，结果见表1。

表1 阳性菌计数 (cfu/mL)

2.3.3 供试品对照组 取供试液1mL，按试验组操作，不加菌液，记录菌落数。

2.3.4 稀释剂对照组 取稀释液1mL代替供试液，按试验组操作，记录菌落数。

2.3.5 回收率计算 试验组的菌回收率(%)=(试验组平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组平均菌落数×100%;稀释剂对照组的菌回收率(%)=稀释剂对照组平均菌落数/菌液组平均菌落数×100%;依法计算回收率，稀释剂对照组的菌回收率均高于70%，试验组的菌回收率见表2/表3。

表2 常规法试验组菌的平均回收率 (%)

表3 薄膜过滤法试验组菌的平均回收率 (%)

2.4 控制菌检查方法验证

取4瓶胆盐乳糖培养基(100mL/瓶)，其中3瓶分别加入1∶10 供试液10mL，一瓶作为样品组，另一瓶加入50～100cfu大肠埃希菌作为阳性对照组，第三瓶加入50～100cfu金黄色葡萄球菌作为阴性菌对照组；剩余一瓶加入10mL稀释剂作为阴性对照；置35℃培养18～24h后，进行MUG及靛基质试验，结果见表4。

表4 控制菌方法验证结果

3 讨论

由表2可见，采用常规法时椎间盘丸、顽痹康丸、芪仲腰舒丸对各试验菌的回收率均高于70%，证明无明显抑菌现象；而颈痛消丸和骨炎托毒丸对某些试验菌的回收率低于70%，说明其有明显的抑菌作用,因此，应重新验证。从表3可以看出，在改用薄膜过滤法后，颈痛消丸和骨炎托毒丸对各试验菌的回收率均高于70%，表明其抑菌作用已消除。由表4可以看出，各供试品对控制菌无明显抑制作用。

根据以上分析，可以确立椎间盘丸、顽痹康丸、芪仲腰舒丸采用常规法进行细菌数的检查，颈痛消丸和骨炎托毒丸采用薄膜过滤法进行细菌数的检查；上述五种医院制剂的霉菌及酵母菌数检查和控制菌检查均可采用常规法进行。

验证试验时，试验用菌株的传代次数不宜超过5代，并应采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证其生物学特性。菌液制备后应在规定期限内使用，菌数应符合药典要求。

药典收载的离心沉淀法仅适用于制备细菌计数或控制菌检查用的供试液，500r/min离心3min只用于去除供试液中的沉淀物，不宜采用高速或长时离心沉降集菌，以免影响供试品中微生物的回收，造成检验结果不能真实反映供试品的污染情况。

测定回收率时，供试液加入菌液后，应及时倾注培养基，以避免有抑菌性的供试液对菌液中的活菌造成损害，影响回收率。

[1] 国家药典委员会. 中国药典(一部)[S]. 北京:中国医药科技出版社,2010:附录79-88.

[2] 中国药品生物制品检定所,中国药品检验总所. 中国药品检验标准操作规范[S]. 北京:中国医药科技出版社,2010:351-407.

[3] 苏德模,马续荣. 药品微生物学检验技术[M]. 北京:华龄出版社,2007:221-227.

[4] 宋勤,杜平华. 中成药微生物限度检查方法的探讨[J]. 中国药事,2006,20(1):46-48.

[5] 杨静. 药品微生物限度检查法的影响因素分析[J]. 中国药事,2008,22(12):1095-1096.

(责任编辑：宋勇刚)

Verification of Methodology on the Microbial Limit Test for Five Hospital Preparations

Yang Yulin，Ji Yingjie

(Luoyang Institute for Food and Drug Control, Henan 471023, China)

Objective:To establish methods of the microbial limit test for five hospital preparations. Methods:Common method and membrane filtration method were used for the verification of methodology on five hospital preparations. Results:The results suggested that common method be used for Zhuijianpan pills, Wanbikang pills and Qizhongyaoshu pills; membrane filtration method for Jingtongxiao pills and Guyantuodu pills. Conclusion:Methods of the microbial limit test for five hospital preparations were established, and its can be used for quality control of those preparations.

Hospital Preparations; Microbial Limit Tests; Verification of Methodology

2014-08-20

杨育林(1978-)，男，河南省洛阳市食品药品检验所主管药师，研究方向为药品检验。

R283

A

1673-2197(2014)23-0024-02