基于酶活性调节的酿酒酵母谷胱甘肽发酵调控研究

方聪明，刘联杰，周安盛，杜 馨，林建国，蔡 俊*

（湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，湖北 武汉 430068）

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是生物体中广泛存在的非蛋白质巯基类三肽化合物，作为一种特殊的肽类，其在真核细胞中占主要地位[1]。GSH在很多的生化过程中起作用，它具有抗氧化、解毒、参与蛋白质修饰及机体内物质转运等功能，这些生理活性作用使其在医药、食品及美容等行业有着很大的应用价值及潜力[2]。在细胞内谷胱甘肽经两步酶催化反应而生成，其中第一步反应中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS，EC 6.3.2.2）由GSH1基因编码合成，并且γ-GCS的活性受GSH的反馈抑制[3-4]。目前生产GSH的主要方法为微生物发酵法，主要利用酿酒酵母和产朊假丝酵母来生物合成[5]。提高酵母细胞内GSH的含量及细胞的生物量是研究中两个主要的指标。生物量的提高是通过高密度发酵来实现，补料分批发酵是进行高密度发酵重要手段，而胞内的GSH含量的提高需首先选育高产GSH的菌种[6-7]，再通过生理环境调节来提高。为了提高这两个指标，很多文献报道研究了发酵培养条件及培养基成分[8-11]、发酵方式[12-13]、前体物质的补加[14-15]和生理环境胁迫[16]等，但GSH产量仍不高，发酵成本较高，无法工业化大规模生产。本实验在研究了GSH合成关键酶γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶活特征的基础上，对补料分批发酵中pH控制和温度进行实验优化，来提高酿酒酵母发酵中GSH的产量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

高产谷胱甘肽酿酒酵母Saccharomyces cerevisiaeCCCG：发酵工程教育部重点实验室保藏。

1.1.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

由本实验室通过含GSH1基因表达质粒的大肠杆菌工程菌诱导表达并分离纯化而制得。具体方法：将大肠杆菌工程菌E.coliBL21（pGEX-GSH1）在LB培养基中经异丙基硫代半乳糖苷（isopropyl thiogalactoside，IPTG）诱导培养，收集菌体，超声波破碎，离心取上清液，过GST-Resin柱，并在层析柱上切除谷胱甘肽转移酶（glutathione S-tranferase，GST）标签，最后获得GSH1重组蛋白，-20 ℃保存。

1.1.3 主要试剂

GSH（分析纯）、庚烷磺酸钠（分析纯）、三磷酸腺苷酸钠（分析纯）：美国Sigma公司；三羟甲基氨基甲烷（分析纯）：美国Amresco公司；预装1mL GST-Resin 重力柱：上海生工生物工程公司；其他试剂均为分析纯并购于上海国药集团。

1.1.4 培养基

大肠杆菌培养基（LB培养基）：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，固体培养基加入20 g/L 琼脂，pH 7.0 左右，121 ℃下灭菌20 min。

酿酒酵母菌种斜面活化培养基（YPD培养基）：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，20 g/L琼脂，pH 6.0左右，115 ℃下灭菌30 min。

一级、二级种子液培养基：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，20 g/L琼脂，pH 6.0，115 ℃下灭菌30 min。

发酵培养基：酵母粉100 g溶于9 L水（成分A）；糖蜜（含可发酵性糖28%）8 L（成分B）；葡萄糖840 g 溶于3 L 水中（成分C）；（NH4）2SO4264 g、NH4H2PO435 g 溶于700 mL水中（成分D），所有各成分121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

30 L Biostat C plus发酵罐：德国贝朗（B.Braun）公司；LC-20AD HPLC系统：日本岛津（Shimadzu）公司；Inertsi ODS-SP色谱柱：岛津技迩公司（GL sciences）。

1.3 方法

1.3.1γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的测定[17]

在1 mL体系中进行γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的测定，缓冲液体系100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），体系中含有20 mmol/L谷氨酸钠、10 mmol/L L-半胱氨酸、5 mmol/L三磷酸腺苷酸二钠、100 mmol/L NaCl、20 mmol/L MgCl2及适量的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，将反应体系置于37 ℃水浴振荡处理30 min，最后加入质量分数10%三氯乙酸0.1 mL终止反应，并离心处理。取离心后的上清液利用磷钼蓝法测定反应过程中产生的无机磷量。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活定义：在一定条件下，单位体积（mL）酶液在单位时间（h）内催化生成1 μmol无机磷的量为一个酶活单位（U）。

1.3.2γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶学特性的分析

根据酶活的测定方法，改变缓冲液体系的反应pH（其变化从6.0至11.0），研究pH对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影响。同样改变缓冲液体系的反应温度（其变化从25 ℃到45 ℃），研究温度对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影响。

1.3.3 菌种活化及种子液培养条件

固体斜面试管30 ℃恒温箱中培养。一级种子液：用接种环取一环已活化好的菌种接入25 mL种子培养基250 mL三角揺瓶中，30 ℃、200 r/min恒温摇床培养18 h。二级种子液：用移液枪吸取10 mL 新鲜的一级种子培养液接入装有100 mL种子液的1 000 mL三角瓶中，30 ℃、200 r/min恒温摇床培养12 h。

1.3.4 发酵罐流加发酵的控制

发酵开始发酵罐中只有发酵培养基成分A，经过灭菌后培养基体积约为10 L，按10%的接种量接入培养好的二级种子，发酵过程中采用分阶段控制策略，发酵前期流加糖蜜（成分B），当菌体湿质量达到150 g/L左右时，开始流加葡萄糖（成分C）至菌体湿质量达到210 g/L 左右时，同时整个过程中一开始就流加氮源（成分D）至加完为止。在这个过程中通过控制转速、通气量、碳源和氮源的流加速度来控制酒精的含量（0.1%vol～0.5%vol）和溶氧量，同时通过酒精的含量来反馈调节碳源的流加速度。发酵过程中的pH用10%稀硫酸和10%的碳酸钠来调节。

1.3.5 细胞生物量测定

取一定体积发酵液5 000 r/min，离心10 min，用去离子水洗涤2次并收集菌体，置于105 ℃烘干至质量恒定，精确称质量，减去离心管干质量即得到酵母的菌体干质量（dry cell weight，DCW）。

1.3.6 发酵液中酒精含量的测定

采用马丁仪微量测定法[18]：准确移取0.05 mol/L酸性重铬酸钾溶液10.0 mL 于球形接收器中，移取10.0 mL 0.06 g/L氢氧化钠溶液倒入隔离管中并加入1.0 mL发酵液，接好仪器加热蒸馏，以沸腾时开始记时，蒸馏5 min。停止后用少量蒸馏水冲洗连接管口，取下接收器迅速冷却至室温，将接收器中的液体全部收集到250 mL三角瓶中，加入2 mL碘化钾溶液及1 mL淀粉指示液，用1.0 mol/L硫代硫酸钠标准液滴定至绿色为终点。

式中：X为乙醇含量，%vol；C为硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L；V1为空白试验消耗的硫代硫酸钠标准液量，mL；V2为试样消耗的硫代硫酸钠标准液量，mL；V3为加入马丁仪中的样品体积，mL；N 稀释倍数；常数0.014 6为1.00 mL 1.0 mol/L硫代硫酸钠标准液相当于乙醇的量。

1.3.7 谷胱甘肽的提取

取一定量的湿菌体于离心管中，加入适当的pH=3.0盐酸溶液，充分振荡至菌体细胞分散均匀并放置冰上处理5 min，再将其放在95～100 ℃下水浴5 min，然后迅速在冰上冷却，再取部分悬液12 000 r/min离心2 min，取离心后的上清液进行GSH的检测。

1.3.8 谷胱甘肽的液相色谱检测

采用LC-20AD液相色谱（HPLC）系统进行检测操作。色谱柱：Inertsi ODS-SP（150 mm×4.6 mm×5 μm）；流动相：磷酸缓冲液与甲醇95∶5（V/V），其中磷酸盐缓冲液为50 mmol/L KH2PO4溶液，内含10 mmol/L庚烷磺酸钠，并用磷酸将缓冲液pH值调至3.0；检测波长：210 nm；UV检测器SPD-20A；流速1.0 mL/min；上样量20 μL。

2 结果与分析

2.1 pH和温度对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活性的影响

图1 pH(A)和温度(B)对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶酶活的影响Fig.1 Effect of pH (A) and temperature (B) on the activity of γ-GCS

对γ-GCS进行酶活分析，得到的结果如图1所示。由图1A可知，γ-GCS催化反应的最适pH为8.5左右，在pH 6.5～8.5的范围内增幅很大。由图1B可知，温度对于γ-GCS的影响是明显的，在25～35 ℃其酶活性逐渐增高，其酶活最适温度为35 ℃左右。

2.2 谷胱甘肽的液相色谱检测

GSH标准品HPLC检测结果如图2所示，酿酒酵母CCCG细胞提取的上清液HPLC检测结果如图3所示。

图2 GSH标准品HPLC检测结果Fig.2 HPLC result of standard GSH

图3 酿酒酵母CCCG细胞提取的上清液HPLC检测结果Fig.3 HPLC result of the extract supernatant of Saccharomyces cerevisiae CCCG

由图2可知，标准GSH在HPLC检测下的保留时间为4.6 min。由图3可知，在4.6 min左右有明显的峰，与左右杂峰有很好的分离度，可以确定图3中10号峰为GSH特征峰，实验中所用HLPC方法可以检测出样酵母细胞抽提液中的GSH含量。

2.3 初始发酵条件下实验结果

图4 初始发酵条件下各控制参数的变化曲线Fig.4 Curve of all fermentation parameters in initial condition

图5 初始发酵条件下菌体生物量、胞内GSH含量与GSH产量的变化曲线Fig.5 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield in initial condition

在初始条件下进行发酵，其过程中的各参数控制如图4所示。由图4可知，发酵温度控制在30 ℃恒定不变，其他参数可调节，发酵后期pH控制在4.5左右。整个过程中乙醇含量和溶氧量是限制性条件，控制发酵液中的乙醇含量在0.1%vol～0.5%vol范围内，溶氧量下降到最低点后调节相关参数至其在5%左右。对于碳源的流加，先流加糖蜜，再加葡萄糖。氮源的流加过程发酵一开始就进行至其加完。控制转速、通气量来调节发酵液中的乙醇含量及溶氧。结果表明，在8～24 h内是各参数变化最大的时间，这一阶段为菌体对数生长期，代谢旺盛。

图5为初始发酵条件下菌体生物量、胞内GSH含量与GSH产量的变情况。由图5可知，菌体生物量（干质量）在36 h达到最大，36～48 h内变化很小。而胞内GSH含量在42 h后才至达最大值，同时GSH产量也在这时候达到最高。发酵结束时，菌体生物量达到（40.70±1.31）g/L，胞内GSH含量为（19.10±0.36）mg/g，GSH产量为（777.37±18.57）mg/L。

2.4 在初始条件基础上进行发酵pH调节的实验结果

图6 pH调节下各控制参数的变化曲线Fig.6 Curve of all fermentation parameters under pH control

图7 pH调节下菌体生物量、胞内GSH含量与GSH产量的变化曲线Fig.7 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield under pH control

发酵过程中温度、溶氧及发酵液中的乙醇浓度维持在初始条件的范围内，进行发酵pH调节，发酵过程中各参数变化见图6所示。由图6可知，结合酶的最适pH值为8.0及其酶活在pH 6.5～8.5的范围内增幅很大，同时也考虑到酿酒酵母生长适合的pH 范围在4.0～6.0之间，发酵过程中0～24 h 内pH 维持在5.5～6.5之间，并在16～24 h逐渐调节到6.5左右，pH的调节可以通过流加碱液、碳源/氮源流加速度等来调节。图7为发酵结束后菌体生物量、胞内GSH含量与GSH产量的变情况。由图7可知，菌体生物量（干质量）在38 h达到最大，38～48 h内变化很小。而胞内GSH含量在36 h就达到最大值，同时GSH产量也在这时候达到最高。发酵结束时，菌体生物量达到（44.80±1.20）g/L，胞内GSH含量为（19.74±0.51）mg/g，GSH产量为（884.35±27.30）mg/L。与初始条件相比较，胞内GSH含量有些增高但变化不大，提高了3.35%，但GSH生物量及胞内GSH含量到达最大值的时间大大缩短，生物量增高了10.07%，最终GSH产量增高了13.76%。

2.5 在初始条件基础上进行发酵温度调节的实验结果

图8 温度调节下各控制参数的变化曲线Fig.8 Curve of all fermentation parameters under temperature control

在初始条件的基础上进行温度优化实验，其他参数pH值、发酵液中乙醇含量、溶氧控制在初始条件的范围内，整个过程通过调节碳源/氮源的流加速度、通气量、转速等来维持，实验中各参数变化情况如图8所示。由图8可知，结合酶的最适温度在35 ℃左右，当温度在35 ℃左右时γ-GCS酶的酶活达到最高，GSH合成第一步反应中获得γ-谷氨酰半胱氨酸量更多，经二步反应后最终合成的GSH也更多。

图9 温度调节下菌体生物量、胞内GSH含量与GSH产量的变化曲线Fig.9 Curve of cell biomass,intracellular GSH content and GSH yield under temperature control

图9为发酵48 h后菌体生物量、胞内GSH含量与GSH产量的变情况。由图9可知，菌体生物量（干质量）在34 h达到最大，34～48 h内变化很小。而胞内GSH含量在42 h后才达最大值，同时GSH产量也在此时达到最高。发酵结束时，菌体生物量达到（46.30±1.55）g/L，胞内GSH含量为（19.84±0.44）mg/g，GSH产量为（918.59±29.22）mg/L。与初始条件相比较，胞内GSH含量提高了3.87%，GSH生物量及胞内GSH含量到达最大值的时间也和初始条件一致，但生物量增高了13.70%，最终GSH产量增高了18.17%。

3 结论

本研究开始以工程菌表达的酿酒酵母γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶为对象，对其酶活特性进行分析，得出γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶在体外最适的pH值及温度。接着以γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶学特性为基础，在酿酒酵母补料分批发酵产GSH的过程中进行pH值控制及温度优化，补料分批培养过程中采用了同时控制碳源（葡萄糖、糖蜜）和氮源补加速度的流加方式，并在发酵过程严格监控发酵液中乙醇含量和溶氧。在初始条件的基础上经pH值优化后，GSH产量达到最大的周期明显缩短，胞内GSH的含量有一定提高，菌体生物量（干质量）和GSH产量有所提高。在温度后优化实验中，发现在温度对菌体生物量的影响明显，温度从30～35 ℃后，菌体生物量（干质量）明显提高，胞内GSH的含量也有一定提高，最终GSH产量有明显提高。综合pH值和温度控制优化的结果来看，pH值和温度不仅可以影响菌体的生物量，同样对胞内GSH含量有一定的提高，这与胞内γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的酶活特性有一致性。

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