食品中大肠杆菌O157∶H7疑似菌株的分离和鉴定研究

杨一群，陈 洋，杜文芳，侯斌斌，毕旺来，李 睿，2*

（1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.农产品加工湖北省协同创新中心，湖北 武汉 430023）

很多肠出血性大肠杆菌都能引起人出现出血性腹泻。美国俄勒冈和密执安州在1982年发生了一些出血性肠炎的爆发流行病例，并从其中一个患者粪便中分离出肠出血性大肠杆菌O157∶H7[1]。O157菌株致病机理非常复杂，stx基因、LEE毒力岛编码intimin的eae基因和大质粒上编码溶血素的hly基因等都是其重要毒力因子[2]。O157主要毒力因子是位于噬菌体基因上的stx1、stx2基因，这两种基因分别编码志贺毒素Stx1、Stx2[3]。目前肠出血性大肠杆菌包括了多种血清型大肠杆菌，如O157、O26、O111等，但O157∶H7血清型仍是引起人类出血性结肠炎的主要致病菌，其还可以引起人患溶血性尿毒综合征等食物中毒并发症，严重者发生急性肾衰竭而死亡[4]。肠出血性大肠杆菌O157∶H7可以通过3种方式进行传播：食源性传播、水源性传播及接触传播。其中食源性传播最为普遍，主要是以牛肉、猪肉等动物性食物为主要载体进行传播[5]。美国、加拿大、日本、英国等国曾多次爆发O157∶H7感染疫情[6]。因此肠出血性O157∶H7的检验检疫一直是世界各地食品安全的重要研究内容[7]。

目前国标法检测O157∶H7有常规平板培养法、免疫磁珠捕获法、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法[8]。平板培养法经过逐级选择性平板培养，阳性菌落做血清学实验和生化实验验证，步骤较多较费时；免疫磁珠捕获法与常规平板培养法步骤类似，操作复杂，费时；PCR虽然快速灵敏，但是假阳性高，只能作为检测O157∶H7的初级手段使用，不能从样本中分离筛选出O157∶H7菌株，阳性样本往往还需要进一步实验验证。

采用以上3种方法，并优化技术路线，对武汉市售食品样品进行O157∶H7快速检测和分离筛选，并鉴定筛选出的O157∶H7疑似菌株，以评估采用的筛选方法的可靠性。本研究结果对今后进行食品中O157∶H7快速检测和筛选鉴定，提高检测准确性，具有积极意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

O157∶H7阳性对照菌株（EC150）：日本九州大学赠送；5株O157∶H7疑似菌株：分别从武汉市售牛肉和猪肉样品中分离得到。

1.1.2 试剂

DNA 分子量标准物、TaqPCR 试剂盒（DR001B）、VT1/VT2检测试剂盒（RR105A）：日本Takara公司；Gold-View核酸染料：赛百盛基因技术有限公司；大肠杆菌O157免疫磁珠分离试剂盒：天津生物芯片技术有限责任公司；O157、H7诊断血清：宁波天润生物药业有限公司；改良山梨糖醇麦康凯琼脂（modified sorbitol macconkey agar，CT-SMAC）、改良O157显色培养基、新生霉素、脑心浸液培养基（brian heart infusion，BHI）培养基：武汉法斯特生物检验技术有限公司；TIANGEN 细菌基因组提取试剂盒：武汉华顺生物技术有限公司；引物委托武汉鼎国生物技术有限公司合成。

1.2 仪器与设备

HMB-400B拍击式均质器：天津市恒奥科技发展有限公司；GBox-HR-E-M凝胶图像系统：英国Syngene公司；台式高速冷冻离心机：德国eppendorf公司；DYY-10C电泳仪：北京六一仪器厂；Tgradient PCR仪：德国Biometra公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

在2013年5～9月期间，在武汉市22个菜市场、大型超市分批采集样品117份。食品样品采集后放入无菌均质袋，冰袋冷藏运回。当天即进行富集培养。无菌操作，称取12.5 g样品，同112.5 mL灭菌TSB培养液一起放入均质袋中，在拍击式均质器中均质90 s，将均质后的培养液转入三角瓶中，37 ℃培养22 h。取菌液1 mL于EP管中，加入甘油冻存。

1.3.2 食品中O157∶H7快速检测和分离筛选流程图

食品中样品O157∶H7快速检测及分离筛选工艺流程见图1。

1.3.3 混合菌液DNA提取

取培养后的菌液1 mL于EP管中，12 000 r/min离心3 min并去掉上清液。按TIANGEN 细菌基因组DNA提取试剂盒说明操作，提取细菌基因组DNA。提取后的DNA溶解在50 μL TE缓冲液中。取5 μL DNA于1%的琼脂糖凝胶电泳，检测细菌DNA是否提取完好。将提取完好的细菌DNA于-20 ℃冰箱中保存。

图1 食品样品大肠杆菌O157：H7快速检测和分离筛选技术流程图Fig.1 Flow chart of screening and separation of E.coli O157∶H7 in food samples

1.3.4 PCR扩增rfbO157、stx基因

VT1/VT2检测试剂盒用来扩增stx1和stx2基因。stx1预期产物大小为349 bp；stx2预期产物大小为404 bp。rfbO157引物及预期产物大小见表1。

表1 PCR引物序列及产物大小Table 1 PCR primer sequence and length of the PCR amplification products

stx基因扩增体系及条件如下：

检测体系：10×buffer 2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；10 μmol/L引物 各0.5 μL；TaqDNA 聚合酶0.15 μL；模板1 μL DNA；dddH2O 18.85 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃延伸10 min。阴性对照用无菌水。

rfbO157基因扩增体系及条件如下：

检测体系：10×buffer 2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；10 μmol/L引物 各0.5 μL；TaqDNA 聚合酶0.15 μL；模板1 μL DNA；dddH2O 18.35 μL。反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。阴性对照用无菌水。

1.3.5 分离O157菌株

将stx以及rfbO157PCR检测结果均为阳性的菌液，复苏。用添加有新生霉素的EC增菌培养液，41 ℃下重新富集培养22 h。取20 μL O157免疫磁珠加入离心管，并加入1 mL增菌液混合，按免疫磁珠试剂盒说明书操作，将离心管放在磁珠分选仪上进行免疫磁珠捕获。吸取所有含免疫磁珠的洗脱液在O157改良显色平板上，涂布一半平板，另一半平板做划线培养。于37 ℃培养20 h。挑取红色阳性单菌落转接CT-SMAC平板，37 ℃培养12 h。将无色阳性菌落用O157诊断血清进行玻片血清凝集实验。同时挑取该无色菌落于PCR管中做菌落PCR。

1.3.6 O157抗原血清学鉴定

分别取1滴O157诊断血清和1滴生理盐水滴在载玻片左右两边，分别用灭菌牙签挑取适量菌泥在O157诊断血清和生理盐水中涂布开，晃动载玻片，在1 min内观察菌体是否出现凝集现象。若生理盐水未出现菌体凝集反应而诊断血清出现凝集反应，则检测的样品为阳性。阳性对照组采用参考菌株EC150。

1.3.7 菌落PCR鉴定stx基因

VT1/VT2检测试剂盒用来扩增stx1和stx2基因。用灭菌牙签在CT-SMAC平板上沾取适量菌体于PCR管中，加入PCR反应液。菌落PCR反应体系为：10×buffer 1 μL；2.5 mmol/L dNTP 0.8 μL；10 μmol/L引物 各0.2 μL；TaqDNA 聚合酶0.08 μL；无菌双蒸水7.72 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性8 min；94 ℃变性30 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min。阴性对照为无菌水。

1.3.8 H7鞭毛抗原血清学鉴定

方法参考文献[9]。将待鉴定的O157∶H7疑似菌株，采用穿刺接种法接种于4%强营养软琼脂中，37 ℃培养过夜后再转接于4%强营养软琼脂，重复穿刺接种培养4次。将鞭毛诱导好的细菌转接于BHI液体培养基中，37 ℃培养过夜，等量加入含1%甲醛的生理盐水，制成待检样。取2支干净小试管，分别加入0.5 mL待检样品和生理盐水，滴加3滴H7诊断血清，50 ℃水浴加热1 h。如生理盐水无凝集，而血清出现絮状沉淀，则待检样品为阳性。

1.3.9 纯菌DNA模板的制备

将待检菌株接种于5 mL LB液体培养基中，37 ℃，培养16 h。取1 mL菌液于离心管中，按1.3.2方法制备DNA。

1.3.10 PCR检测fliCH7基因

PCR反应体系为：10×buffer 2.5 μL；2.5 mmol/L dNTP 2 μL；0.2 μmol/L引物 各0.5 μL；TaqDNA 聚合酶0.15 μL；模板1 μL DNA；dddH2O：18.35 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，59 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。阴性对照用无菌水。引物参考文献[10]合成。

2 结果与分析

2.1 食品中O157∶H7疑似菌株的检测、分离和筛选

采用图1所示流程，对117份食品样品进行了PCR扩增，经检验，117份样品中有55份样品rfbO157基因PCR检测结果显示阳性，但其中有20份样品stx基因检测结果为阴性，stx和rfbO157基因同时检出为阳性的样品有35份。

从这35份样品中挑选部分样品，经过免疫磁珠分离、显色培养基培养、O157诊断血清玻片凝集反应鉴定等步骤，分离筛选出4株O157∶H7疑似菌株，但有一份样品经过免疫磁珠捕获后在O157显色培养基上培养时，菌落为红色，在CT-SMAC平板上菌落为无色，呈现出典型的O157阳性菌落特征。但用O157单价血清做玻片凝集实验时，挑选的单菌落均无法与O157诊断血清产生凝集反应，始终无法从该阳性样品中分离到阳性单菌落。该份样品改用菌落PCR法筛选单菌，筛出1株O157∶H7疑似菌株，命名为EC5.11。EC5.11菌落PCR检测结果电泳图样如图2所示。

图2 stx基因菌落PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of colony PCR amplification products of stx gene

由图2可知，5种O157∶H7疑似菌株均携带stx基因。

2.2 O157∶H7疑似菌株的鉴定

将5株O157∶H7疑似菌株重新分离纯化后，按1.3.8方法进行H7鞭毛诱导恢复。然后进行H7抗原血清学鉴定。5株菌中仅有1株菌EC9.101有较明显的凝集反应。5株菌都能与O157抗原发生凝集反应，但凝集反应程度不同，EC5.11仅能与O157诊断血清产生微弱凝集反应。用PCR方法对5株菌的rfbO157及fliCH7基因进行检测。PCR检测结果电泳图分别如图3、图4所示。

图3 rfbO157基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification products of rfbO157gene

由图3可知，5株菌rfbO157检测结果均为阳性，表明5株菌O抗原为O157血清型。

图4 fliCH7基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR amplificatio products of fliCH7gene

由图4可知，4株菌fliCH7为阳性。经过PCR和血清学实验最终确定出，5株疑似菌株有4株为O157∶H7型，菌株EC9.102为O157血清型，H抗原血清型待定。

3 结论

本研究发现，EC5.11在O157改良平板和CT-SMAC平板上生长时，均呈现典型的O157阳性菌落特征，但无法与O157诊断血清发生良好凝集反应。反之，很多细菌如赫氏埃希菌因与O157具有类似抗原，也能与O157诊断血清产生强凝集反应[11-12]。因此血清学方法是一种可靠性比较差的筛选方法，单一采用血清学鉴定的方法分离和鉴定O157：H7非常不可靠。

很多O157菌株不携带stx基因，这些菌株不能产生志贺毒素，对人类健康影响较少[13]。本次研究有20份样品检出rfbO157基因阳性，但stx基因检测结果为阴性。我国公布的行业标准致病菌PCR检测法仅单一扩增O157标志基因rfbO157，并不能说明食品中污染的O157是否具有致病力[14]。因此对食品中O157污染状况进行检测评估时，建议采用三重PCR先进行初筛，同时检测O157抗原标志基因比如rfbO157、志贺毒素编码基因stx1和stx2。此方法较之行业标准方法，可以对食品中O157的毒力状况进行较全面的判定。

国标法在O157∶H7分离筛选流程中，先后采用了CT-SMAC、O157改良显色培养基、TSI培养基、MUG-LST肉汤等进行选择性培养和初步生化鉴定，阳性菌落再进行血清学实验。在实际筛选工作中发现，TSI、MUG-LST针对O157∶H7特异性并不强，因此筛选流程中去除了这两种培养基。经过免疫磁珠捕获、O157改良显色培养基和CT-SMAC选择性培养后，将阳性菌落同时做血清学鉴定和菌落PCR，可以在减少工作量同时提高PCR阳性样本中O157菌株的分离率，避免漏筛。

在进行H7鞭毛抗原血清学鉴定时，有4株菌表现为阴性，但在PCR鉴定fliCH7时，这4株菌中有3株都为H7鞭毛抗原阳性。很可能是在进行菌体鞭毛诱导时，鞭毛生长不充分或根本没有长出鞭毛。很多类似研究也证实O157∶H7疑似菌株采用血清学鉴定和PCR鉴定时，结果差异较大[15]。因此血清学鉴定的结果不可以作为实验最终结果，只能作为参考。PCR鉴定更灵敏，特异性更强，适合在菌株筛选和鉴定中作为主要方法使用。

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