E-cad、Snail表达与DukesB期大肠癌浸润、转移、预后的关系

2014-04-12许映郑伯安邓高里董全进赵仲生

浙江医学 2014年3期

许映郑伯安邓高里董全进赵仲生

许映郑伯安邓高里董全进赵仲生

目的研究E-cad、Snail表达与大肠癌侵袭、转移和预后的关系。方法采用免疫组化EnVision法，分别检测E-cad、Snail在正常大肠黏膜上皮、大肠腺瘤及大肠癌患者癌组织中的表达。结果E-cad的表达与肿瘤分化程度、浸润深度、静脉、淋巴管侵犯、淋巴结转移与否及Dukes分期状况密切相关（均P＜0．05），而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤病理类型无相关性（均P＞0．05）。45例Dukes B期的大肠癌患者中7例E-cad染色阴性，其1、3、5年生存率分别为85．71%、57．14%、0．00%；38例为中度阳性或强阳性，其1、3、5年生存率分别为97．37%、65．79%、39．47%，两者比较有统计学差异（P＜0．01）。Snail表达与肿瘤病理类型、分化程度、浸润深度、静脉、淋巴管侵犯、淋巴结转移与否及Dukes分期明显相关（均P＜0．05），而与年龄、性别、肿瘤大小无相关性（均P＞0．05）。45例Dukes B期的大肠癌患者中26例Snail染色阴性，其1、3、5年生存率分别为100．00%、69．23%、42．31%；19例为中度阳性或强阳性，其1、3、5年生存率分别为89．47%、57．89%、26．32%，两者比较有统计学差异（P＜0．01）。多因素分析结果显示：肿瘤淋巴结转移、Dukes分期、E-cad表达强度、Snail表达强度可预示患者术后生存情况（均P＜0．05）。E-cad与Snail在大肠癌组织中的表达呈显著负相关（r=-0．508，P＜0．01）。结论E-cad与Snail可作为大肠癌患者的独立预后指标，预示患者术后生存情况。Dukes B期大肠癌患者中，E-cad阴性者预后明显较阳性者为差；Snail阳性者的预后明显较阴性者为差。

Dukes B期大肠癌 E-cad Snail浸润转移预后

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病率有逐年上升的趋势。尽管近年来以手术治疗为主的综合治疗使大肠癌患者的预后有所改善，但术后5年生存率仍徘徊在50.00%～60.00%左右。恶性肿瘤的浸润和转移是患者术后死亡的主要原因[1]。因此，阐明大肠癌浸润和转移相关的分子机制及与患者预后的关系，从而指导临床治疗方案的选择，可望达到减少术后复发和转移、提高术后生存率的目的。

E-cad是与大肠癌浸润和转移较为密切的黏附分子，有抑制肿瘤浸润转移的功能。另有研究发现在许多肿瘤中，锌指转录因子Snail的表达与E-cad表达的减少或缺失相关，而且充当E-cad转录的直接抑制因子。本研究检测了正常大肠黏膜、大肠腺瘤和大肠癌中，E-cad和Snail的表达与患者临床病理特征的相关性，并初步探讨两者在Dukes B期大肠癌患者肿瘤浸润转移中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象收集1988—2001年浙江省人民医院肛肠外科和富阳市人民医院外科大肠癌手术患者的组织标本共142例，其中浙江省人民医院102例，富阳市人民医院40例。所有患者诊断均经手术和病理检查证实。其中男80例，女62例；年龄15～78岁，中位年龄55岁；肿瘤直径＜3cm者15例，3～5cm者101例，＞5cm者26例；病理类型：乳头状腺癌13例，管状腺癌90例，黏液腺癌39例；分化程度：高分化者15例，中分化者96例，低分化者31例；Dukes分期：A期38例，B期45例，C期48例，D期11例。随访时间4～142个月，中位随访时间55.04个月。另选择同时期正常大肠黏膜标本30例和大肠腺瘤标本30例为对照。标本均常规以10%甲醛溶液固定，石蜡包埋。每例蜡块行4μm连续切片，分别进行HE染色和免疫组化染色。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂即用型鼠抗人E-cad单克隆抗体为福州迈新生物技术开发中心产品，鼠抗人Snail（H-130）单克隆抗体购自美国Biotechnology公司，免疫组化En-Vision system试剂盒购自美国DAKO基因有限公司。

1.2.2 免疫组化染色 E-cad及Snail染色采用EnVision法，切片经微波抗原修复，以已知阳性片作为阳性对照，以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.2.3 E-cad及Snail染色评分标准 E-cad阳性标准为细胞边界细胞膜均匀染有棕黄色者为阳性，Snail阳性标准为细胞膜和细胞质内均匀染有棕黄色者为阳性。低倍镜下观察，选择表达较集中的10个视野，换高倍镜计数阳性细胞，按着色细胞百分比（I）分类为：＜10%，I= 0分；≥10%且≤90%，I=1分；＞90%，I=2分。根据染色强度（P）分类：阴性0分；弱阳性1分；中度阳性2分；强阳性3分。表达情况以（P+I）表示：阴性=0～1分，中度阳性=2～3分，强阳性=4～5分[2]。

1.3 统计学处理应用SPSS 11.5统计软件，计数资料间比较采用χ2检验或Fisher确切概率法，等级分组资料比较采用秩和检验。生存率比较采用Kaplan Meier检验；多因素生存率分析采用Cox回归模型。相关性分析用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 E-cad和Snail在正常大肠黏膜上皮、大肠腺瘤、大肠癌组织中的表达 30例正常大肠黏膜中E-cad染色均匀地分布在细胞边界的细胞膜上，其中3例（10.00%）呈中度阳性，27例（90.00%）呈强阳性。30例大肠腺瘤中1例（3.33%）呈阴性，10例（33.33%）呈中度阳性，19例（63.33%）呈强阳性。而142例大肠癌患者中30例（21.13%）呈阴性，53例（37.32%）呈中度阳性，59例（41.55%）呈强阳性（图1，见插页）。3组间比较均有统计学差异（均P＜0.05）。

30例正常大肠黏膜中28例（93.33%）Snail染色呈阴性，只有2例（6.67%）为中度阳性，无强阳性表达。30例大肠腺瘤中22例（73.33%）呈阴性，8例（26.67%）呈中度阳性，也无强阳性表达。而142例大肠癌中68例（47.89%）为阴性，60例（42.25%）中度阳性，14例（9.98%）呈强阳性（图2，见插页）。3组间比较均有统计学差异（均P＜0.05）。

2.2 E-cad和Snail表达与大肠癌患者临床病理特征的关系 E-cad阳性表达与肿瘤分化程度、浸润深度、静脉侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Dukes分期均密切相关（均P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤病理类型无明显相关性（均P＞0.05）。Snail表达与肿瘤病理类型、分化程度、静脉侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Dukes分期均密切相关（均P＜0.05），而与年龄、性别、肿瘤大小均无明显相关性（均P＞0.05），见表1。

2.3 大肠癌中E-cad和Snail表达的相互关系 142例患者的大肠癌组织中E-cad表达阴性、中度阳性和强阳性分别为30、53和59例。而Snail表达阴性、中度阳性和强阳性分别为68、60和14例。E-cad与Snail在大肠癌组织中的表达呈显著负相关（r=-0.508，P＜0.01）。

2.4 E-cad和Snail表达与大肠癌预后的关系 142例患者中E-cad染色阴性者共30例，其1、3、5年生存率分别为86.67%、53.33%、33.33%；E-cad呈中度阳性者共53例，其1、3、5年生存率分别为92.45%、60.38%、45.28%；E-cad染色呈强阳性者共59例，其1、3、5年生存率分别为100.00%、76.27%、49.15%。提示E-cad呈阴性者预后最差，强阳性者预后最好，呈中度阳性者预后居中，3者间比较有统计学差异（P＜0.01）。

142例患者中Snail染色呈阴性表达者68例，其1、3、5年生存率分别为100.00%、70.59%、47.06%；中度阳性表达者共60例，其1、3、5年生存率分别为90.00%、63.33%、46.67%；强阳性表达者共14例，其1、3、5年生存率分别为85.71%、50.00%、21.43%。提示Snail阴性表达者预后最好，呈强阳性者预后差，呈中度阳性者居中，3者间比较有统计学差异（P＜0.01）。

2.5 大肠癌预后相关因子的多因素回归分析 Cox多因素回归分析提示，淋巴结转移、Dukes分期、E-cad表达强度、Snail表达强度与大肠癌预后密切相关（均P＜0.05），可作为独立的预后指标；而性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤病理类型、分化程度、浸润深度、静脉侵犯、淋巴结转移等因素与大肠癌预后均无明显相关性（均P＞0.05），见表2。

2.6 E-cad和snail的表达与Dukes B期大肠癌患者生存的关系 45例Dukes B期大肠癌患者中，7例E-cad染色为阴性，其 1、3、5年生存率分别为 85.71%、57.14%、0.00%；38例E-cad染色为中度阳性或强阳性，其1、3、5年生存率分别为97.37%、65.79%、39.47%，E-cad阴性者预后明显较阳性者差（P＜0.01），两者生存曲线见图3。

45例患者中26例Snail染色为阴性，其1、3、5年生存率分别为100.00%、69.23%、42.31%；19例Snail染色为中度阳性或强阳性，其1、3、5年生存率分别为89.47%、57.89%、26.32%。Snail阳性者预后明显较阴性者差（P＜0.01），两者生存曲线见图4。

3 讨论

肿瘤的浸润和转移包括一系列步骤：肿瘤细胞脱离原发灶，侵犯周围组织，进入循环系统，转移至靶器官并增殖[3]。早在20世纪40年代，人们就发现恶性肿瘤细胞间的相互黏附作用明显低于正常细胞。细胞间的黏附抑制可触发癌细胞脱离原发灶，使癌细胞获得浸润特性。基于细胞的黏附功能在恶性肿瘤的组织发生、浸润和转移中起着极为重要的作用，近年来黏附分子在肿瘤浸润和转移中的作用及其分子生物学机制成为研究的热点。黏附分子包括整合素类、CD44、钙黏附蛋白类、免疫球蛋白超家族、凝集素类等，E-cad是与大肠癌浸润和转移较为密切的黏附分子。

E-cad是一簇跨膜糖蛋白，通过同种亲合作用引起钙依赖性细胞间黏附。细胞含有的E-cad分子越少，其黏附功能越差。既往研究揭示，人体恶性肿瘤细胞中的E-cad常呈不同程度的低表达，表达减低的肿瘤浸润能力强，淋巴结转移和远处转移率高，生存率相对较低。Lioni等[4]研究证实E-cad黏附能力的丧失是获得去分化和有侵袭力表型的第一步，Chu等[5]和Herzig等[6]研究发现E-cad的确有抑制肿瘤浸润转移的功能。Peinado等[7]报道，当E-cad被特异性抗体阻断后，无浸润力的非转化Madin Darby犬的肾上皮细胞（MDCK）重新获得浸润特性。由此提示E-cad表达丧失是恶性表型进展的关键步骤。E-cad与大肠癌关系的研究是近年来开展的新课题，各家的研究结果也并非一致。Zlobec等[8]应用免疫组化和原位杂交技术检测了1 164例大肠癌标本，结果显示E-cad蛋白的低表达不仅与大肠癌细胞的分化有关，还与淋巴结转移和患者的预后呈正相关。Ngan等[9]应用免疫组化技术检测了140例大肠癌组织中E-cad蛋白的表达情况，结果显示E-cad蛋白在术后生存期＞5年的患者标本中的表达强度明显高于生存期＜5年者，提示E-cad蛋白的表达水平是影响大肠癌患者预后的指标。

锌指转录因子Snail属于转录抑制因子中的Snail超家族，首次在果蝇中被描述，该基因突变的果蝇胚胎呈原肠胚缺陷的表现型，经证实与E-cad下调有关。研究发现在许多肿瘤中Snail的表达与E-cad表达的减少或缺失相关，而且充当E-cad转录的直接抑制因子。Snail主要以其锌指区域与E-cad启动子中的Epal元件（-178到+92bp）E盒结构主链上的CANNTG序列结合，从而发挥下调E-cad表达的作用[10]。在上皮细胞中Snail过度表达可导致向成纤维细胞的转化，同时E-cad表达丢失伴随肿瘤发生并获得侵袭或转移特性。

本研究结果显示，从正常大肠黏膜到腺瘤再到大肠癌，E-cad的表达逐渐减弱；而Snail的表达则逐渐增强。E-cad、Snail表达与分化程度、浸润深度、静脉侵犯、淋巴管侵犯、淋巴结转移、Dukes分期密切相关，表明两者与大肠癌的浸润和转移密切相关。同时相关性分析结果显示，Snail与E-cad呈负相关，这与文献报道一致。E-cad呈中度阳性和强阳性的大肠癌患者，生存率明显高于E-cad阴性者；而Snail呈中度阳性和强阳性的大肠癌患者，生存率明显低于Snail阴性者。联合检测两者在大肠癌中的表达可作为大肠癌预后的指标。近年来，Snail表达异常导致的E-cad表达的变化已在多种肿瘤中被证实，包括乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、恶性黑色素瘤及口腔鳞癌等。

在肿瘤进展中引起E-cad下调的分子机制的研究是近年的热点，既往研究认为主要有以下3方面原因：（1）基因的缺失、失活及转录、翻译异常；（2）转录启动子高度甲基化；（3）E-cad因恶性肿瘤蛋白分解活性升高而降解[11]。近年来转录因子Snail的表达上调已见于报道，即E-cad功能紊乱发生在转录水平。Snail是E-cad转录的直接抑制因子，它与E-cad表达呈负相关，而与肿瘤的侵袭性及转移性呈正相关[12]。Poser等[12]证实，在黑色素细胞中以RT-PCR不能检测到Snail的表达，而在所有8种黑色素瘤细胞系中却均呈明显表达。同时Western blot和RT-PCR检测提示在黑色素瘤细胞中E-cad表达显著降低。由此可知，Snail表达的变化与E-cad的下调密切相关。异常表达Snail的上皮细胞显示出成纤维细胞的表现型，并且获得肿瘤发生和侵袭特性，因此Snail可作为恶性肿瘤的标志物，从而有助于开发特异性的抗肿瘤转移药物。

表2 大肠癌患者生存率的独立预后因素

目前Dukes A期大肠癌因预后较好，故术后不需行辅助化疗，而Dukes C期大肠癌预后较差，术后需辅助化疗已成为共识，而Dukes B期的患者术后是否需要辅助化疗尚有较多争议。本研究显示在Dukes B期的大肠癌患者中，E-cad阴性者较阳性者（包括中度阳性及强阳性）预后差；Snail阳性者（包括中度阳性及强阳性）较阴性者预后差，而在Dukes A期和Dukes C期中两组患者生存率之间比较无差别。因此，在处理Dukes B期的患者时，按E-cad、Snail表达的不同，应采取不同的处理方法，即E-cad阴性或Snail阳性视为高危复发人群，应给予辅助化疗；而对于E-cad阳性或Snail阴性的患者可视为低危患者，无需给予辅助化疗，避免了患者的过度治疗。

图3 Dukes B期大肠癌患者E-cad表达与生存的关系

图4 Dukes B期大肠癌患者Snail表达与生存的关系

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Expression of E-cad and Snail in Dukes B colorectal cancer and its relation to tumor invasion,metastasis and prognosis

Objective To investigate the expression of E-cad and Snail in Dukes B colorectal cancer and its relation to tumor invasion,metastasis and prognosis．MethodsThe expression of E-cad and Snail was detected by immunohistochemical EnVision method in 45 cases of Dukes B colorectal cancer．ResultsThe staining intensity of E-cad significantly was correlated with tumor differentiation,invasive depth,lymph node metastasis and Dukes stage,but not with age,gender,tumor size and pathological types．Among 45 cases of Dukes B colorectal cancer,E-cad was negatively expressed in 7 cases and positively expressed in 38,the 1-,3-and 5-year survival rate of negative E-cad and positive E-cad cancer were 85．71%,57．14%,0．00% and 97．37%,65．79%,39．47%,respectively(P＜0．01)．The staining intensity of Snail was significantly correlated with differentiation, pathological types,invasive depth,venous vessel invasion,lymphatic vessel invasion,lymph node metastasis and Dukes stage, but not with age,gender and tumor size．In 45 cases of Dukes B cancer,Snail was negatively expressed in 26 cases and positively expressed in 19 cases,the 1-,3-and 5-year survival rate of negative Snail expression and positive Snail expression cancer was 100．00%,69．23%,42．31%and 89．47%,57．89%,26．32%,respectively(P＜0．01)．The multivariate survival analysis demonstrated that lymph node metastasis,Dukes stage,expression of E-cad or Snail can predict survival of patients with colorectal cancer．ConclusionDukes B colorectal cancer with negative expression of E-cad or positive expression of Snail has poor prognosis．

Dukes B stage colorectal cancer E-cad Snail Invasion Metastasis Prognosis