白芍总苷对内毒素性心肌炎大鼠心肌组织炎症因子的影响

2014-04-12蒋旭宏华军益潘智敏何煜舟叶武毛威阮善明丁黎敏黄兆铨

浙江医学 2014年3期

蒋旭宏华军益潘智敏何煜舟叶武毛威阮善明丁黎敏黄兆铨

蒋旭宏华军益潘智敏何煜舟叶武毛威阮善明丁黎敏黄兆铨

目的研究白芍总苷（TGP）对内毒素性心肌炎大鼠心肌组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、NF-κB表达的影响。方法通过尾静脉注入脂多糖（LPS）建立内毒素性心肌炎大鼠模型，分别以低、中、高剂量的TGP进行干预，光镜观察大鼠心肌组织的病理学变化，免疫组化检测心肌组织TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达水平。结果光镜观察发现模型组大鼠心肌组织炎症反应明显，较多炎症细胞浸润；TGP中、高剂量组大鼠心肌组织炎症反应较轻，有少量炎症细胞浸润；低剂量组大鼠心肌组织炎症坏死程度介于模型组和中剂量组之间。免疫组化检测提示TGP中、高剂量组TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达明显减少，与模型组比较均有统计学差异（均P＜0．01）；TGP低剂量组的TNF-α、IL-1β表达与模型组均无统计学差异（均P＞0．05），而NF-κB的表达与模型组有统计学差异（P＜0．05）。结论TGP能有效抑制内毒素性心肌炎大鼠心肌组织炎症反应，减轻心肌损伤，在中、高剂量时效果明显。

白芍总苷内毒素血症心肌炎 TNF-α IL-1β NF-κB

严重感染、创伤、休克、手术等致病因素常常并发内毒素血症，诱发全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），甚至多器官衰竭，进而严重威胁患者生命。心肌损伤是内毒素血症的常见并发症，发生率约为50%，内毒素血症患者出现心功能障碍大约占40%，一旦发生心脏并发症，患者病死率即由20%上升到70%～90%[1]。因此，如何有效预防和治疗内毒素血症患者的心肌损伤变得至关重要，但目前临床尚无有效治疗内毒素血症性心肌炎的方法。笔者既往研究发现，中药白芍的提取物白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）对内毒素性心肌炎的炎症反应有抑制作用，本研究拟进一步观察TGP对心肌组织中TNF-α、IL-1β、NF-κB的蛋白表达水平的影响，以阐明TGP防治内毒素性心肌炎的作用机制，为进一步开发利用浙江道地药材白芍提供参考。

1 材料和方法

1.1 实验动物和试剂清洁级雄性Wistar大鼠50只由浙江中医药大学实验动物中心提供，体重（200±20）g。脂多糖（LPS）购自美国Sigma公司，TGP（批号：H20055058）购自宁波立华制药有限公司，TNF-α、IL-1β、NF-κB p65抗体均购自美国Santa Cruz公司，DAB显色剂、免疫组化二步法试剂盒、浓缩型DAB试剂盒（ZLI-9032）为北京中杉金桥公司产品。

1.2 方法 50只Wistar大鼠在实验室分笼饲养1周，室温维持25℃，自由进食、饮水。以随机数字表法将大鼠分为5组（每组各10只）：（1）空白组：以0.9%氯化钠溶液4ml灌胃，1次/8h，共3次。（2）模型组：在10min内通过尾静脉注射LPS 5mg/kg，再予0.9%氯化钠溶液4ml灌胃，1次/8h，共3次。（3）TGP低剂量组：在10min内通过尾静脉注入LPS 5mg/kg，再将TGP 100mg/（kg· d）溶于0.9%氯化钠溶液12ml中，取4ml灌胃，1次/8h，共3次。（4）TGP中剂量组：在10min内通过尾静脉注入LPS 5mg/kg，再将TGP 200mg/（kg·d）溶于0.9%氯化钠溶液12ml中，取4ml灌胃，1次/8h，共3次。（5）TGP高剂量组：在10min内通过尾静脉注入LPS 5mg/kg，再将TGP 300mg/（kg·d）溶于0.9%氯化钠溶液12ml中，取4ml灌胃，1次/8h，共3次。所有大鼠末次给药后禁食、自由饮水12h，以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后予处死，收集心肌组织，制片待测。

1.3 心肌组织TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达检测采用免疫组化二步法，具体操作按试剂盒说明书进行，400倍光镜下采集图像，阳性染色为深棕黄色。计分标准：每张切片随机选取5个高倍视野，根据着色程度及着色细胞阳性范围进行计算。着色程度：0分，不着色；1分，着色淡；2分，中等着色；3分，着色深。着色细胞阳性范围：0分，无着色；1分，着色阳性细胞＜1/3；2分，着色阳性细胞1/3～1/2；3分，着色阳性细胞＞1/2。将着色程度与着色细胞阳性范围得分各自相加为其最后计分，取平均数。

1.4 统计学处理采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t检验。

2 结果

2.1 心肌组织病理学观察结果 HE染色后镜下观察提示，空白组大鼠心肌细胞的结构清晰，心肌纤维完整，未见坏死组织和炎症细胞浸润；模型组大鼠心肌细胞水肿明显，结构模糊，部分坏死灶，心肌组织较多炎症细胞浸润；TGP中、高剂量组大鼠心肌细胞有轻度水肿，结构可分辨，有少量坏死灶，心肌组织少量炎症细胞浸润；TGP低剂量组大鼠心肌组织水肿程度和炎症坏死程度介于模型组和中剂量组之间（图1，见插页）。

2.2 心肌组织中TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达检测免疫组化提示空白组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白有少量表达，模型组心肌组织细胞质、细胞核中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白均有明显表达，特别是细胞核中表达明显，与空白组比较均有统计学差异（均P＜0.01）；TGP低剂量组TNF-α、IL-1β蛋白表达较高，与模型组比较均无统计学差异（均P＞0.05），而NF-κB蛋白表达与模型组比较有统计学差异（P＜0.05）；TGP中、高剂量组TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表达均明显少于模型组（均P＜0.01），见表1和图2-4（见插页）。

表1 各组大鼠心肌组织中TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达（分）

3 讨论

内毒素血症是严重感染、创伤和手术等引起急危重症时常见并发症[2]，体内的内毒素、TNF-α和IL-1β等水平明显升高，TNF-α和IL-1β是发病过程中最重要的炎性介质，可引发“级联”反应，导致炎性介质“瀑式”释放，加剧机体的炎症反应及组织器官的损伤，甚至导致多器官功能衰竭[3]。其中，心功能障碍是患者最严重的并发症之一，病死率高，其病理机制往往与内毒素性心肌炎有关，炎症因子被认为在此发病中占主导地位[4]。内毒素血症可导致心肌细胞变性和坏死，激活内源性阿片系统，进而NF-κB信号转导途径，引起一系列的炎症反应[5]。上调多种炎症介质和细胞因子基因转录和表达，尤其是TNF-α、IL-1β等原发性炎症介质的增加，NF-κB、TNF-α和IL-1β的释放可进一步引起心肌细胞凋亡和心肌重构[6]，如何减轻内毒素性心肌炎的炎症反应是防治的关键。

白芍（杭白芍）是浙江的道地药材，著名的“浙八味”之一。白芍始载于《神农本草经》，据《明医别录》记载，白芍“通顺血脉，缓中”可治“时行寒热”，其味苦、酸、微寒、归肝脾经。具有平肝镇痛，养血调经，敛阴止汗功效[7]。杭白芍主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷、苯甲酰羟基芍药苷等苷类成分，从杭白芍中提取精制的TGP具有抗炎、免疫调节、抑制细胞凋亡、抗氧自由基等多种药理作用[8]。笔者受《难经·十四难》“损其心者，调其营卫”理念的启发，以“调扶营卫”为治疗大法采用TGP干预内毒素性心肌炎大鼠，观察心肌组织的炎症因子TNF-α、IL-1β、NF-κB的含量变化，以此明确TGP对内毒素性心肌炎炎症反应的抑制作用。

本研究通过尾静脉注入LPS建立内毒素性心肌炎大鼠模型，用低、中、高剂量的TGP分别进行干预，发现模型组大鼠心肌组织炎症反应明显，心肌细胞明显水肿，结构模糊，部分坏死灶，心肌组织较多炎症细胞浸润；TGP中剂量组和高剂量组大鼠心肌组织炎症反应较轻，心肌细胞有轻度水肿，少量坏死灶，心肌组织有少量炎症细胞浸润；TGP低剂量组大鼠心肌组织炎症坏死程度介于模型组和中剂量组之间。免疫组化检测提示，TGP中、高剂量组TNF-α、IL-1β、NF-κB的表达明显减少，与模型组比较有统计学差异，在中、高剂量组之间则差别不明显；低剂量组TNF-α、IL-1β与模型组比较无统计学差异，而NF-κB的表达与模型组比较有统计学差异。

综上所述，本研究发现TGP能有效抑制内毒素性心肌炎大鼠心肌组织炎症反应，减轻心肌损伤，而且在中、高剂量时效果明显，此结果可为临床应用TGP防治内毒素性心肌炎提供实验参考。

[1]Angus D C,Linde-Zwirble W T,Lidicker J,et al．Epidemiology of severe sepsis in the United States：analysis of incidence,outcome,and associated costs of care[J]．Crit Care Med,2001,29 (7)：1303-1310．

[2] Sonnier D I,Bailey S R,Schuster R M,et al．Proinflammatory ehemokines in the intestinal lumen Contribute to intestinal dysfunction during endotoxem[J]．Shock,2012,37(1)：63-69．

[3] 田金飞,汤彦．脓毒血症研究进展[J]．内科急危重症杂志,2012,18(1)：14-16．

[4] Magnani J W,Dec G W．Myocarditis current trends in diagnosis and treatment[J]．Circulation,2006,113(6)：876-890．

[5] Triantafilou K,Triantafilou M．Coxsackievirus B4-induced cytokine production in pancreatic cells is mediated through toll-like receptor 4[J]．J Virol,2004,78(20)：11313-11320．

[6] 梁英健,李鑫,张晓娟,等．NF-κB在脓毒症血浆诱导的内皮细胞损伤和凋亡中的作用[J]．中国病理生理杂志,2013,29(8)：1508-1511．

[7]浙江省食品药品监督管理局．浙江省中药炮制规范(2005版)[M]．杭州：浙江科技出版社,2006：34-35．

[8] 谢仲德,李文烈,方应权,等．白芍中芍药苷的闪式提取工艺研究[J]．中成药,2013,35(9)：2037-2039．

Effect of total glucosides of paeony on expression of inflammatory factors in myocardial tissue of rats with myocarditis induced by endotoxin

Objective To investigate whether total glucosides of paeony (TGP)could inhibit expression of inflammatory factors in myocardial tissue of rats with myocarditis．MethodsMyocarditis was induced by injection of endotoxin LPS through the tail vein in rats;then low,middle or high doses of TGP were administered by gastric perfusion respectively．Histopathological changes were examined by HE staining;the expression of TNF-α,IL-1βand NF-κB in myocardial tissue was detected by immunohistochemistry．ResultsHistopathology demonstrated marked inflammation in cardiac tissue with infiltration of inflammatory cells．TGP with middle and high dose alleviated inflammation in cardiac tissue．Expression of TNF-α,IL-1βand NF-κB was up-graded in rats with myocarditis,which was attenuated in middle and high dose-TGP groups(P＜0．01)．ConclusionTGP with middle or high dose can effectively inhibit inflammation in cardiac tissue of rats with endotoxin-induced myocarditis．

Total glucosides of paeony Endotoxemia Myocarditis TNF-α IL-1β NF-κB