MiRNA-24在良、恶性胸水鉴别诊断中的应用价值研究

2014-04-12张斌杰乐涵波张永奎刘晓光周吉航竺王玉陈志军

浙江医学 2014年3期

张斌杰乐涵波张永奎刘晓光周吉航竺王玉陈志军

张斌杰乐涵波张永奎刘晓光周吉航竺王玉陈志军

目的研究良性与恶性胸水中miRNA表达的差异，为临床早期鉴别良、恶性胸水提供依据。方法抽取18例肺癌患者及10例肺部良性病变患者的胸水，运用茎环逆转录荧光定量PCR法检测let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表达水平，分析其在良、恶性胸水中的表达差异。结果miRNA-24在恶性胸水中的表达高于在良性胸水中的表达，差异有统计学意义（P=0．032），而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在良、恶性胸水中的表达差异无统计学意义（P=0．076、0．320、0．076、0．372）。结论miRNA-24在恶性胸水中高表达，检测胸水中miRNA-24的表达水平可能是新的鉴别胸水良、恶性的手段。

胸腔积液 microRNA 诊断

肺癌是一种严重威胁人类健康和生命的疾病，在我国其病死率仍呈明显上升趋势，其病死人数已位居国内各类肿瘤死亡人数首位[1]。胸腔积液（胸水）是肺癌等多种胸部疾病常伴发的一个重要临床表现。鉴别胸水的良、恶性对患者的治疗及预后具有重要意义。特别是对于仅有胸腔积液，但影像学及细胞学检测均为阴性的患者，胸水良、恶性的鉴别具有重要的诊断意义。miRNA是一类存在于真核细胞中的内源性非编码单链小RNA，通过与目标mRNA的3′非编码区互补配对，抑制miRNA的翻译，导致基因沉默。近年多项研究表明，miRNA与多种人类恶性肿瘤细胞的发生、侵袭转移及凋亡有着密切的联系[2-3]。

本研究检测肺癌及肺部良性病变患者的let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表达差异，并与胸水癌胚抗原（CEA）、糖类抗原19-9（CA19-9）进行比较，分析miRNA表达水平在良、恶性胸水鉴别诊断中的临床应用价值，现报道如下。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2011-01—2012-12我院抽取胸水的患者共28例。其中肺癌患者（除肺癌外无其他主要疾病，恶性胸水组）18例，男10例，女8例，年龄43～89（62.5±11.9）岁；肺部良性病变患者（良性胸水组）10例，男5例，女5例，年龄39～91（64.1±13.9）岁。所有胸水标本均在抽取后半小时内放入-80℃冰箱中冻存。

1.2 方法

1.2.1 抽提胸水miRNA 使用美国ABI公司试剂盒抽提胸水中的miRNA，操作严格按照说明书进行。抽提的miRNA浓度采用ABI公司的TaqMan探针利用荧光定量PCR仪进行检测并分析。

1.2.2 茎环逆转录荧光定量PCR法检测胸水中miRNAs表达以U6为内参，let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a与U6同批扩增，每个样本做3个复孔，取平均值。应用TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒（美国ABI公司）将miRNA转录为cDNA，反应体系为10×RT缓冲液 0.75μl，RNA酶抑制剂0.095μl，dNTP0.075μl，逆转录酶0.5μl，引物1.5μl，模板1.5μl，用DEPC水稀释到7.5μl，反应条件为16℃30min，42℃30min，85℃5min；应用7500实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）检测miRNA表达，试剂为TaqMan通用混合液Ⅱ，反应体系为10μl TaqMan无尿素酶2×通用PCR混合液,1μl基因特异引物，1μl模板，DEPC水稀释至20μl，反应条件为95℃10min，95℃15s 40个循环，60℃1min。循环数（Ct）值由SDS 2.0.1 Software（美国ABI公司）计算，以U6为内参，计算miRNA的2-ΔCt值。无核苷酸水代替模板的反应体系为阴性对照，肺癌细胞株A549作为阳性对照。

1.2.3 胸水CEA、CA19-9检测采用化学发光法检测胸水中CEA、CA19-9水平，使用Beckman Coulter公司UnicelDXI800化学发光仪及原配套试剂。CEA＞5.0ng/ ml，CA19-9＞37.0IU/ml判定为阳性。

1.3 统计学处理采用SPSS13.0统计软件，计量资料以表示，比较采用两独立样本t检验。相关性分析采用Pearson相关性检验。

2 结果

2.1 良、恶性胸水中miRNAs表达见表1。

表1 良、恶性胸水中miRNA表达（2-ΔCt）

由表1可见，miRNA-24在恶性胸水中的表达明显高于在良性胸水中的表达，差异有统计学意义（P=0.032），而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在恶性胸水中的表达虽然高于在良性胸水中的表达，但差异无统计学意义（P=0.076，0.320，0.076，0.372）。

2.2 良、恶性胸水CEA、CA19-9表达良、恶性胸水的肿瘤标志物的含量的检测结果显示，CEA与CA19-9在恶性胸水中的水平[（1160±515.4）、（237.6±96.2）ml]均明显高于良性[（237.6±96.2）、（10.16±6.461）ml]，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。在良、恶性胸水中，mirRNA-24与CEA和CA199的表达均无明显相关性（r=-0.086，P＞0.05）。

3 讨论

目前国内对miRNA的研究主要集中于血清及肿瘤细胞上，对胸水中miRNA的研究相对较少，胸水的抽取或者引流本身即为胸腔积液患者治疗的一种基本方法，其操作创伤性相对较小，获得的标本量较大，是一种比较理想的检测标本。所以，通过检测胸水中miRNA的种类与含量来鉴别胸水的良、恶性有重要的意义与较好的实用性。

我们运用逆转录荧光定量PCR技术检测良、恶性胸水中let-7b、miRNA-24、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a的表达,发现miRNA-24在恶性胸水中的表达高于在良性胸水中的表达，并且差异有统计学意义，而let-7b、miRNA-27b、miRNA-30d、miRNA-128a在良、恶性胸水中的表达虽然也有差异，但差异无统计学意义。Xie等[4]应用一种外源性的植物miRNA-athmiRNA-156a作为内参，对110例胸水（包括28例良性，82例恶性）中miRNA-24及miRNA-30d的表达水平进行了检测，结果发现miRNA-24和miRNA-30d在恶性胸水中的表达要明显高于在良性胸水中的表达，其差异均有统计学意义。本研究结果与Xie等的研究结果不完全相同，出现这种差异可能与两个研究的研究样本量均偏小以及两个研究所选用的内参基因不同有关。

miRNA-24在细胞中主要起到调节细胞生长与凋亡的功能。在不同肿瘤的生长、发展及凋亡过程中，其既可能作为原癌基因存在，又可能作为抑癌基因发挥作用。Xie等[5]通过研究肺癌细胞、宫颈癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞发现：miRNA-24可以通过降低X-染色体连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）的表达，从而降低肿瘤细胞凋亡的阈值，促进肿瘤细胞的凋亡。而Cameron等[6]通过研究受到EB病毒感染的B淋巴细胞发现，在这些受感染的B淋巴细胞中miRNA-24的表达水平明显升高，提示miRNA-24可能在EB病毒介导的淋巴瘤的发生过程中起促进作用。

本研究同时发现，恶性胸水中CEA及CA19-9的表达水平亦高于良性胸水，其差异有统计学意义。该结果提示CEA及CA19-9可作为良、恶性胸水的一项鉴别指标。我们进一步分析了胸水中miRNA-24与CEA、CA19-9的相关性，结果分析表明胸水中miRNA-24与CEA及CA19-9之间无相关性。上述结果提示胸水miRNA-24、CEA及CA19-9均可以用于鉴别良、恶性胸水，其中miRNA-24可作为一项独立的预测因素，与胸水CEA、CA19-9无关，对于胸水CEA、CA19-9阴性的恶性胸水患者有一定的鉴别意义。

综上所述，miRNA-24在良、恶性胸水中的表达存在明显差异，其可作为良、恶性胸水鉴别的一项有效指标。与胸水中传统的肿瘤标志物CEA及CA19-9相比，miRNA-24是一项独立的恶性胸水的预测指标，对胸水CEA、CA19-9阴性的患者有一定的预测意义。胸水miRNA-24的表达情况的检测可以作为一种新的鉴别良、恶性胸水的方法，值得推广应用。

[1]Guo P,Huang Z L,Yu P,et al．Trends in cancer mortality in China：an update[J]．Annals of Oncology,2012,23(10)：2755-2762．

[2]Brennecke J,Hipfner D R,Stark A,et al．Bantam encodes a developmentally regulated microRNA that controls cell proliferation and regulates the pro-apoptotic gene hid in Drosophila[J]．Cell, 2003,113(1)：25-36．

[3]Gupta G P,Massagué J．Cancer metastasis：building a framework[J]．Cell,2006,127(4)：679-695．

[4]Xie L,Wang T,Yu S,et al．Cell-free miR-24 and miR-30d,potential diagnostic biomarkers in malignant effusions[J]．Clinical Biochemistry．2011,44(2-3)：216-220．

[5]Xie Y,Tobin L A,Camps J,et al．MicroRNA-24 regulates XIAP to reduce the apoptosis threshold in cancer cells[J]．Oncogene,2013, 32(19)：2442-2451．

[6]Cameron J E,Fewell C,Yin Q,et al．Epstein-Barr virus growth/latency III program alters cellular microRNA expression[J]．Virology, 2008,382(2)：257-266．

MicroRNA-24 is expressed at high level in malignant pleural effusion

Objective To investigate the expression levels of microRNAs in malignant and benign pleural effusion．MethodsPleural effusion samples were collected from 18 cases of lung cancer and 10 cased of benign diseases．The expression levels of let-7b,miRNA-24,miRNA-27b,miRNA-30d and miRNA-128a in the pleural effusion were detected with stem loop primer FQ RT-PCR method．ResultsThe expression of miRNA-24 in malignant pleural effusion was higher than that in benign pleural effusion(P=0．032);however there were no significant difference in expression of Let-7b,miRNA-27b,miRNA-30d and miRNA-128a between malignant and benign pleural effusion(P=0．076,0．320,0．076 and 0．372,respectively)．ConclusionmiRNA-24 is expressed at higher level in malignant pleural effusion,indicating that miRNA-24 may be used to differentiate malignant pleural effusion from benign one．

Pleural effusion MicroRNA Diagnosis