虎杖内生真菌抗菌活性研究及菌株初步鉴定

彭 浩， 陈文强， 邓百万， 兰阿峰

(陕西理工学院 生物科学与工程学院，陕西省食药用菌工程技术研究中心， 陕西 汉中 723000)

0 引 言

内生菌(endophyte)是指那些在其生活史中的某段时期或全部阶段生活在植物组织内，对植物组织没有明显引起病害症状的一类真菌[1]，其分布广泛，主要生长在植物表皮下的组织当中。近年来，国内外研究人员从多种药用植物内生菌的代谢产物中分离出具有各种生理活性的物质[2-3]。药用植物内生真菌产生的生物活性物质存在极大的多样性，如具有抗肿瘤、抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗虫等[4-7]，表明药用植物内生真菌能够产生结构新颖、功能特殊的次生代谢产物，是新化合物、新药物的潜在资源，它们在医药、工业、农业等领域具有重要的应用前景[8]。

虎杖(Polygonumcuspidatum)始载于《名医别录》，为蓼科植物虎杖的根茎(《中国药典》第194页)，主要分布在我国湖北、四川、陕西等20多个省份。其性味微苦，微寒，归肝、胆、肺经，具活血散瘀定痛，清热解毒利湿，化痰止咳通喘之功效[9-10]。主要有效成分为芪类和蒽醌类化合物，前者包括白藜芦醇及其糖苷[11]，据报道白藜芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和具有对冠心病、缺血性心脏病、高血脂症的防治作用[12-13]，白藜芦醇已被列为抗心血管疾病、抗癌最有前途的药物之一[14]。虎杖煎剂在体外对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、变形杆菌、绿脓杆菌等均有一定抑制作用[15-16]。

药用植物虎杖自身具有较明显的抑菌作用，在内生菌与其长期协同进化的过程中，其基因的互相交换使得部分内生菌具有和虎杖类似的抑菌作用。国内有关虎杖内生真菌抗菌活性的研究，仅有曾松荣等在分离得到的24株虎杖内生真菌中发现，有3株内生真菌分别对枯草芽孢杆菌、藤黄八叠球菌(Micrococcusluteus)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、乙型副伤寒杆菌(SalmonellaparatyphiB)、白色念珠菌(Moniliaalbican)、掷孢酵母(Sporobolomycetaceaesp.)等8种受试菌均有明显抑制作用。

秦巴山区生境独特、气候温暖湿润，药用植物资源丰富，而有关虎杖内生真菌的分离及抗菌活性的相关研究报道甚少。本研究通过对分离自秦巴山区虎杖根茎的30株内生真菌进行抑菌研究，旨在掌握该地区具有抑菌作用虎杖内生真菌的多样性，寻找新的抑菌活性物质，为进一步研发抗菌新药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 供试菌株

虎杖内生真菌30株，由陕西省食药用菌工程技术研究中心提供。

1.1.2 靶标菌株

大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)共4种，购自中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。

1.1.3 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(g/L)：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂20.0 g；马铃薯葡萄糖(PDB)培养基(g/L)：去皮马铃薯200.0 g，葡萄糖20.0 g；牛肉膏蛋白胨培养基(g/L)：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂20.0 g，pH 7.2；沙氏琼脂(SDA)培养基(g/L)：蛋白胨10.0 g，葡萄糖40.0 g，琼脂20.0 g，pH 5.6 ± 0.2。查氏(Czapek)培养基(g/L): NaNO32.0 g，K2HPO41.0 g，KCl 0.5 g，MgSO40.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30.0 g，琼脂15.0 g，pH 6.7。

1.1.4 主要仪器与设备

恒温振荡器(ZHWY-2102C，上海智诚分析仪器制造有限公司)，超净工作台(SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司)，电子天平(BJ100M，上海精科天美科学仪器有限公司)，立式蒸气灭菌器(LS-B50L，上海医用核子仪器厂)，人工气候箱(LRH-800-GS，韶关市明天环保仪器有限公司)等。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的活化

内生真菌活化：无菌条件下，分别将30株虎杖内生真菌采用点植法转入PDA试管斜面中，(28±1)℃下培养，菌丝满斜面后置于4 ℃恒温箱中保藏备用。

靶标菌株的活化：无菌条件下，分别将大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌转入牛肉膏蛋白胨试管斜面及沙氏琼脂试管斜面中，(36±1)℃下培养，待菌苔形成后，置于4 ℃恒温箱中保藏备用。

1.2.2 内生真菌的液体培养及发酵液处理

将分离纯化好的内生真菌菌株在无菌条件下，取0.5 mm×0.5 mm菌块接种于盛有200 mL PDB培养基的三角瓶中，28 ℃，160 r/min振荡培养7 d。将培养的内生真菌发酵液先以8 000 r/min的转速离心10min，上清液经0.45 μm滤膜过滤并将滤液装入无菌小三角瓶中，置于4 ℃恒温箱中保藏备用。

1.2.3 菌株发酵液抑菌试验

采用滤纸片扩散法[17]，挑取少量活化24～48 h的靶标菌株，在装有10 mL无菌水的试管中反复洗涤，摇匀，制成菌悬液。用微量取液器分别取大肠埃希氏菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌菌悬液各0.2 mL注入牛肉膏蛋白胨培养基和沙氏琼脂平板表面，无菌玻棒涂布均匀，然后将以虎杖内生真菌发酵液浸泡2 h、直径为8.0 mm的无菌滤纸片贴到培养基表面，每皿贴4片，每2片为1株菌的发酵液，(36±1)℃培养24～48 h后观察，并测量抑菌圈直径。

1.2.4 菌株的初步鉴定

将有抑菌活性的内生真菌菌株转入查氏平板中，(28±1)℃培养5～7 d，观察菌丝生长并作记录。待平板里菌落不再有明显增大后，根据菌落形态特征、菌丝结构以及孢子形态等结合《真菌鉴定手册》及《常见与常用真菌》[18-19]对其进行初步分类鉴定。

2 结果与分析

2.1 虎杖内生真菌抑菌试验

通过1.2.3方法对30株虎杖内生真菌发酵液进行抑菌活性试验，结果见表1、图1。

表1 虎杖内生真菌抑菌试验

注：“+”表示抑菌直径为8～10 mm；“++”表示抑菌直径为10～14 mm；“+++”表示抑菌直径为14～19 mm；“-”代表没有抑菌圈。

(a)大肠杆菌(Escherichia coli) (b)枯草杆菌(Bacillus subtilis)

(c)金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (d)白色念珠菌(Candida albicans) 图1 虎杖内生真菌抑菌试验结果

表1、图1结果表明，共有16株内生真菌的发酵液对3种受试菌有不同程度的抑制作用，占菌株总数的53.3%。且在16株具抑菌活性的菌株中，15株菌对金黄色葡萄球菌有抑制作用，占93.7%。其中F225、L101、L112、L213对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用；12株菌对枯草芽孢杆菌有抑制作用，占75.0%。其中F104、F225、L102、L112、L213、L256对枯草芽孢杆菌有较强抑制作用；7株菌对大肠埃希氏杆菌有抑制作用，占43.7%。其中L101、L237抑制作用明显，菌株L101对大肠埃希氏杆菌、枯草芽孢杆菌及金黄色葡萄球菌均有明显抑制，此试验中的30株虎杖内生真菌中暂未发现对白色念珠菌有抑制作用的菌株。

研究结果表明，筛选出的16株菌株对革兰氏阳性细菌均具有明显的抑制作用，而只有部分菌株对革兰氏阴性细菌有抑制作用，这与孔亚男等[20]对虎杖内生放线菌的抑菌活性研究结果相一致。

2.2 菌株的初步鉴定

根据1.2.4方法对16株具有抑菌活性的内生真菌菌株进行初步鉴定，结果表明这些真菌分属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目淡色孢科曲霉属(Aspergillussp.)、青霉属(Penicilliumsp.)，半知菌亚门丝孢纲丝孢目暗色孢科枝孢属(Cladosporiumsp.)，半知菌亚门丝孢纲瘤座孢目镰刀菌属(Fusariumsp.)及半知菌亚门丝孢纲无孢菌目无孢科无孢菌类(Agonomycetalessp.)真菌(表2)。

表2 抑菌菌株种群组成及抑制类型

表2结果表明，具抑菌活性的16株虎杖内生真菌分属半只菌亚门3目、4科、5属，具有一定物种多样性，而丝孢目真菌占抑菌菌株的56%。同时，在上述菌株中，曲霉属有2株菌对G-、G+细菌均有抑制作用，3株菌只对G+细菌有抑制作用；青霉属有3株菌对G-、G+细菌均有抑制作用，1株菌只对G+细菌有抑制作用；枝孢属的2株菌只对G+细菌有抑制作用；镰刀菌属有1株菌对G-、G+细菌均有抑制作用，2株菌只对G+细菌有抑制作用；无孢菌类1株菌对G-、G+细菌均有抑制作用，1株菌只对G+细菌有抑制作用。

3 讨 论

植物内生菌在近一个多世纪的研究过程中，有越来越多的内生菌先后被分离、纯化。同时，紫杉醇、喜树碱、三尖杉酯碱、鬼臼素及长春花碱等具有抗癌活性的物质也从这些内生菌的代谢产物中被检测发现。表明植物内生菌是极具潜力的一个微生物资源宝库，具有重要的医药应用价值，必将在天然药物研究中得到广泛开发和利用[21-23]。

虎杖作为传统中药在我国已有千年的使用历史，其本身就具有抗菌、抗病毒、镇咳、平喘等作用。虎杖内生真菌由于在和虎杖长期协同进化的过程中发生了基因相互交换，使得部分内生真菌具有和虎杖类似的药理作用。本研究采用滤纸片扩散法对30株虎杖内生真菌发酵液进行抑菌活性试验，其中15株内生真菌对金黄色葡萄球菌具有抑菌活性，12株内生真菌对枯草芽孢杆菌具有抑菌活性，7株内生真菌对大肠埃希氏菌具有抑菌活性，分别占菌株总数的50%，40%和23%。根据菌落形态及菌丝结构对其初步鉴定，具有抑菌活性的菌株分属于曲霉属、青霉属、枝孢霉属、镰刀菌属及无孢菌类真菌。此研究为进一步保护、利用、开发虎杖内生真菌宝贵资源和研发新颖的抗菌药物具有一定作用。

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