基底膜蛋白多糖对成骨细胞增殖及BMP-2分泌影响

马金龙，褚言琛，张成栋，邹云雯

(青岛大学附属医院骨科，山东 青岛 266003)

骨折愈合是一个复杂而连续的过程，分为血肿炎症机化期、原始骨痂形成期、骨板形成塑形期，三者之间是相互交织逐渐演进的过程，其中，成骨细胞的作用贯穿整个骨折愈合过程[1]。细胞外基质对细胞的形态、结构、功能等具有重要的影响，而基底膜蛋白多糖是细胞外基质的关键组成部分[2]，具有传递细胞间信号的重要作用[3]。基底膜蛋白多糖是细胞外基质之一，本文研究其与成骨细胞之间的关系，探讨其对骨折愈合的作用，以期为骨折愈合提供理论依据。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 成骨细胞提取及培养

取12 h内新生大鼠8只(不分质量、不分雌雄，购自青岛市药物科学研究所)，25 g/L碘附常规消毒3 min，断头，取光滑颅骨，PBS液中浸洗后剪成直径约0.5 mm大小的碎片，浸入2.5 g/L胰蛋白酶消化，离心，去上清液， 应用1 g/L的Ⅱ型胶原酶消化，离心，取细胞沉淀，用PBS液洗涤后滤网滤除杂质，以DMEM低糖培养液重悬细胞，吹打后接种，培养箱传代培养。

1.2 成骨细胞的鉴定

应用茜素红法(钙化结节染色)：取第3代成骨细胞，胰酶消化完全后接种于盖玻片上，置于6孔培养板上培养箱中培养24 h，待接种成功后，取出盖玻片，PBS冲洗，甲醛固定，去固定液后10 g/L茜素红染色，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗3次后拍照。

1.3 细胞增殖活性检测

取生长活跃的第3代成骨细胞，随机分为基底膜蛋白多糖抑制剂组(A组)、空白对照组(B组)、低氧状态下基底膜蛋白多糖抑制剂组(C组)、低氧状态下对照组(D组)。在96孔板中每孔加100 μL配

制好的细胞悬液培养24 h。然后A组每孔加基底膜蛋白多糖抗体(1∶100培养基稀释后)10 μL及细胞培养液(含体积分数0.10胎牛血清、100 kU/L青霉素以及100 mg/L链霉素的DMEM低糖培养液)10 μL；B组每孔加20 μL细胞培养液；C组每孔加浓度150 μmol/L的二氯化钴(CoCl2，细胞培养液稀释)10 μL及串珠素抗体(1∶100)10 μL；D组每孔加150 μmol/L的CoCl2溶液10 μL及细胞培养液10 μL。另设置空白孔10个，即只有培养液而没有细胞。将培养板在培养箱中分别培养24、48、72 h，每组中每个时间点增设10个检测复孔。在每个时间点各组各孔均加入CCK溶液10 μL。然后置入培养箱孵育2 h后用酶标仪测定450 nm处的吸光度(A)，计算细胞增殖活性。细胞增殖活性(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100%。A(加药)：具有细胞、CCK溶液和药物溶液孔的吸光度；A(空白)：具有培养液和CCK溶液而没有细胞孔的吸光度；A(0加药)：具有细胞、CCK溶液而没有药物溶液孔的吸光度。

1.4 ELISA法检测成骨细胞中骨形态发生蛋白2(BMP-2)的表达

在6孔板中每孔加1 mL细胞悬液培养24 h后，换等量无血清培养液继续培养12 h，按1.3方法分为A、B、C、D共4组，A组加基底膜蛋白多糖抗体100 μL及细胞培养液100 μL；B组加细胞培养液200 μL；C组加150 μmol/L的CoCl2溶液100 μL及串珠素抗体100 μL；D组加150 μmol/L的CoCl2溶液100 μL及细胞培养液100 μL。持续培养24、48、72、96 h后，以3 000 r/min离心10 min，取细胞上清液。设置标准品孔和样本孔, 用酶标仪测定450 nm波长处吸光度(A)值。通过绘制标准曲线求标本中BMP-2的浓度。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组成骨细胞增殖活性比较

随培养时间增加，4组成骨细胞增殖活性均升高，差异有显著性(F=14.62～960.06，P<0.05)。培养24、48 h，A组与B组比较、C组与D组比较成骨细胞增殖活性均降低，差异有显著性(t=4.51～18.04，P<0.05)；培养72 h各组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.2 各组BMP-2表达比较

随培养时间增加，4组BMP-2表达均增加，差异有显著性(F=234.04～1 667.83，P<0.05)。培养24、48、72、96 h，A组与B组比较、C组与D组比较成骨细胞BMP-2表达降低，差异有显著意义(t=6.61～30.50,P<0.05)。见表2。

表1 各组细胞增殖活性比较

表2 各组培养不同时间BMP-2表达比较

3 讨 论

3.1 基底膜蛋白多糖对成骨细胞早期增殖的影响

细胞外基质对细胞增殖和分化有重要的调控作用，其中很大一部分作用要通过细胞外基质中的蛋白聚糖发挥。基底膜蛋白多糖是细胞分泌到细胞外发挥作用的蛋白多糖，用基底膜蛋白多糖抗体阻断其作用的方法在理论上是可行的。有研究表明，低氧状态下或用基底膜蛋白多糖抗体中和内源性基底膜蛋白多糖，大鼠血管内皮细胞增殖和对成纤维细胞生长因子的反应均降低，这可能是通过抑制黏着斑激酶(FAK)介导的信号转导途径实现的[6]。

本文的结果显示，在成骨细胞增殖早期(48 h内)，无论是常氧状态还是低氧状态下，阻断细胞外基底膜蛋白多糖后，细胞的增殖活性明显下降，差异有显著性，表明基底膜蛋白多糖对成骨细胞早期的增殖活性具有重要意义。基底膜蛋白多糖HS侧链与生长因子结合，调节细胞因子的活性，影响细胞的增殖[7-8]。同时，HS侧链具有调节细胞黏附的作用，其核心蛋白与侧链的协同作用对于细胞黏附是必需的[9]。这可能进一步影响了细胞的增殖活性。

3.2 基底膜蛋白多糖对成骨细胞晚期增殖的影响

本实验结果显示，在成骨细胞增殖的晚期(72 h后)，A组、C组细胞的增殖活性与B组、D组比较，差异无显著性。细胞因子可有多种信号转导通路，成骨细胞加入基底膜蛋白多糖抗体后再培养72 h，其阻断细胞外基底膜蛋白多糖对细胞因子的影响可能通过其他通路的代偿作用而减弱。而且在培养72 h后，成骨细胞数目逐渐增多，细胞密度较大，基底膜蛋白多糖对细胞聚集、黏附等作用的影响可能不明显。提示其可能主要在细胞增殖的早期发挥重要作用。但低氧依然明显影响了成骨细胞的增殖活性，说明低氧对成骨细胞的增殖影响是全面的，其原因可能涉及细胞内、细胞外多种机制。

3.3 基底膜蛋白多糖对成骨细胞分泌BMP-2影响

研究显示，BMP-2有促进体外培养的成骨细胞分化和诱导其成骨的能力。GUTIERREZ等[10]证实，BMP-2诱导C2C12细胞向成骨细胞分化时，能够促进多种细胞外基质中蛋白多糖的分泌，其中就包括含有HS侧链的基底膜蛋白多糖。这说明骨髓干细胞在向成骨细胞分化过程中，BMP-2能够增强基底膜蛋白多糖的表达。BMP-2与基底膜蛋白多糖通过互相作用进一步增强其对成骨的促进作用。本实验结果显示，各个时间点A组、C组成骨细胞BMP-2表达量均较B组、D组明显降低，提示基底膜蛋白多糖对BMP-2的合成有促进作用。

综上所述，在成骨细胞增殖早期基底膜蛋白多糖对成骨细胞增殖活性有显著影响，并对成骨细胞分泌BMP-2具有明显的促进作用。然而，基底膜蛋白多糖对骨折愈合的促进作用仍待进一步的研究，其临床意义也需要进一步探讨。

[参考文献]

[1] EINHORN T A. The cell and molecular biology of fracture healing[J]. Clin Orthop Relat Res, 1998,355(Suppl): S7-S21.

[2] ARIKAWA-HIRASAWA E L A, functional mutations of the perlecan gene cause Schwartz-Jampel syndrome. With myoto-nic myopathy and chondrodysplasia[J]. J Hum Genet, 2002,70(5):1368-1375.

[3] IOZZO R V. Perlecan: a gem of a proteoglycan[J]. Matrix Biol, 1994,14(3):203-208.

[4] 周晓彬,张健. 医学统计软件系统PPMS 1.5的应用举例[J]. 齐鲁医学杂志, 2011,26(6):502-505.

[5] 周晓彬. 医用统计学软件 PPMS 1. 5 在医学科学研究中的应用价值[J]. 青岛大学医学院学报, 2011,47(6):504-506.

[6] LI Y Z, LIU X H, CAI L R. Down-regulation of perlecan expression contributes to the inhibition of rat cardiac microvascular endothelial cell proliferation induced by hypoxia[J]. Sheng Li Xue Bao, 2007,59(2):221-226.

[7] WHITELOCK J M, MURDOCH A D, IOZZO R V, et al. The degradation of human endothelial cell-derived perlecan and release of bound basic fibroblast growth factor by stromelysin, collagenase, plasmin, and heparanases[J]. Biol Chem, 1996,271(17):10079-10086.

[8] ACHEN M G, STACKER S A. The vascular endothelial growth factor family; proteins which guide the development of the vasculature[J]. Int J Exp Pathol, 1998,79(5):255-265.

[9] BJORNSON A, MOSES J, INGEMANSSON A, et al. Primary human glomerular endothelial cells produce proteoglycans, and puromycin affects their posttranslational modification[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2005,288(4): F748-F756.

[10] GUTIERREZ J, OSSES N, BRANDAN E. Changes in secreted and cell associated proteoglycan synthesis during conversion of myoblasts to osteoblasts in response to bone morphogenetic protein-2: role of decorin in cell response to BMP-2[J]. J Cell Physiol, 2006,206(1):58-67.