苦菜对尼古丁中毒 小鼠血清乙酰胆碱含量的影响

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(河北农业大学,河北保定 071001)

苦菜Ierischinxensis(Thunb.)Nakai又名山苦菜、中华苦荬菜,是菊科苦荬菜属植物[1]。苦菜含有丰富的营养成分和生理活性物质,具有较高的营养价值和保健作用,也是一种药食同源的植物[2],具有清热、解毒、消炎、凉血、止痛、消肿、抗肿瘤等功效。苦菜在我国分布广泛,野生资源丰富,食用、药用历史悠久,化学成分及药理作用复杂[3-6]。

赵云玲等[7]以生理盐水为对照,对烟碱中毒的小白鼠和家兔分别用苦菜干品口服液、注射液、鲜品口服液进行解毒实验,实验结果表明,苦菜鲜品口服液对烟碱中毒家兔和小白鼠具有明显的解救作用。通过这一实验,初步证明了苦菜的抗烟碱作用;许光鸿[8]尝试用苦菜治疗家畜烟碱中毒,取得了较好的疗效。但是,这些研究只是通过对动物烟碱中毒的症状进行简单的观察实验,并没有任何客观指标的研究。乙酰胆碱是一种重要的神经递质,尼古丁作用于烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs),急性给予尼古丁引起α4β2亚型和α7亚型nAChRs功能性上调,使突触前膜去极化增强,Ca2+内流增加,突触传递增强,从而促进神经递质释放[9]。因此,本研究以小鼠血清乙酰胆碱的含量作为观察指标,探索苦菜对尼古丁中毒的拮抗作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性昆明种小鼠(18～22g) 北京阜康生物科技有限公司;苦菜 采自河北农业大学西校区,经河北农业大学生命科学学院植物学系冯大领老师鉴定为菊科苦荬菜属植物苦菜Ierischinxensis(Thunb.)Nakai;99%尼古丁 陕西弘康生物科技有限公司提供;乙酰胆碱(Ach)测定试剂盒 南京建成生物工程研究所;无水乙醇 天津市进丰化工有限公司。

JJ-2组织捣碎匀浆机 金坛市杰瑞尔电器有限公司;台式高速离心机 德国艾本德股份公司;RE_52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;Thermo Scientific全波长酶标仪 美国Thermo fisher scientific公司。

1.2 实验方法

1.2.1 小鼠尼古丁中毒症状观察 取9只小鼠,随机分为3组,每组3只。分别注射0.12、0.3、0.6mg/mL的尼古丁溶液,注射量均为0.1mL/10g·bw,观察小鼠中毒躯体症状、重新开始活动时间、注射后第一次进食时间。

1.2.2 苦菜对尼古丁中毒小鼠的血清乙酰胆碱含量的影响 120只小鼠随机分为尼古丁组、苦菜汁组和空白组,每组40只又按时间点分为5组,每组每个时间点8只小鼠。尼古丁组和苦菜汁组背部皮下注射0.6mg/mL的尼古丁溶液,空白组背部皮下注射0.9%氯化钠注射液,注射剂量均为0.1mL/10g·bw。每只小鼠注射后马上灌胃,尼古丁组和空白组灌胃自来水,苦菜汁组灌胃苦菜汁,灌胃剂量均为0.2mL/10g·bw。苦菜汁为全株新鲜苦菜100g加自来水100mL经组织捣碎匀浆机、尼龙纱布过滤所得滤液。每组小鼠在灌胃后5、15、30、45、60min分别摘眼球取血。血液凝固后于4℃,3500r/min离心15min,分离血清,-28℃冰箱冷冻保存待测。

1.2.3 苦菜不同部位对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响 32只小鼠随机分为尼古丁组、苦菜叶组、苦菜根组和空白组,每组8只小鼠。空白组背部皮下注射0.9%氯化钠注射液,其余三组均背部皮下注射0.6mg/mL的尼古丁溶液,注射量均为0.1mL/10g·bw。注射后即刻灌胃,尼古丁组和空白组灌胃自来水,其他组灌胃相应的苦菜样品,灌胃量均为0.2mL/10g·bw。苦菜叶汁为新鲜苦菜叶100g加自来水100mL经组织捣碎匀浆机、尼龙纱布过滤所得滤液。苦菜根汁为新鲜苦菜根100g加自来水100mL经组织捣碎匀浆机、尼龙纱布过滤所得滤液。在灌胃后45min摘眼球取血。制备血清,同1.2.2。

1.2.4 苦菜提取物对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响 32只小鼠随机分为尼古丁组、干提物组、鲜提物组和空白组,每组8只小鼠。干苦菜提取物(干提物)为新鲜苦菜经真空冷冻干燥、中药粉碎机粉碎成粉,取50g,按料液比1∶8加入60%乙醇溶液,超声提取1h,40℃旋转蒸发去乙醇后所剩液体。鲜苦菜提取物(鲜提物)为新鲜苦菜50g,按料液比1∶8加入60%乙醇溶液,超声提取1h,40℃旋转蒸发去乙醇所剩液体。各组处理同1.2.3。在灌胃后45min摘眼球取血。制备血清,同1.2.2。

1.2.5 指标测定方法 血清乙酰胆碱含量测定方法按照试剂盒说明书进行。

2 结果与分析

2.1 小鼠尼古丁中毒剂量选择

小鼠注射尼古丁后,迅速出现中毒症状。注射低剂量尼古丁溶液(0.12mg/mL)后,自发活动先小幅度增加,后减少,只在小范围活动,并出现挠头、竖起、舔爪等症状;注射0.3mg/mL尼古丁溶液后,小鼠活动先迅速增加,然后减少至停下不动,并出现翘尾、呼吸困难、头部上仰、弓背、眯眼、间隔性抽搐等症状;注射0.6mg/mL尼古丁溶液后,症状与前者相似。但重新开始活动时间和第一次进食时间如表1所示。由观察结果可见注射0.3mg/mL和0.6mg/mL尼古丁溶液后中毒症状明显,考虑灌胃消化时间,选择0.6mg/mL为皮下注射剂量。

表1 小鼠尼古丁中毒症状Table 1 Symptoms of nicotine poisoning in mouse

2.2 苦菜汁对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响

结果如图1所示。与空白组相比,给药后,尼古丁组和苦菜组小鼠血清乙酰胆碱含量明显升高,并随时间延长而降到正常水平。尼古丁组在灌胃后5、15、30、45min,分别高出空白组9%、33%、14%、32%,方差分析结果表明在灌胃后5、15、30、45min与空白组相比均有显著性差异(p<0.05);苦菜组小鼠血清乙酰胆碱含量在前期与尼古丁组趋势相似,但在45min时小鼠血清乙酰胆碱含量低于尼古丁组11%,与尼古丁组有显著性差异(p<0.05),所以选择灌胃后45min作为后续实验的取血时间;在60min时,三组小鼠血清乙酰胆碱含量之间无显著性差异。实验结果表明苦菜汁对尼古丁中毒小鼠出现的血清乙酰胆碱含量升高有一定抑制作用。

图1 苦菜对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响 Fig. 1 The effect of Ieris chinxensis(Thunb.) Nakai juice on serum acetylcholine content in mouse

2.3 苦菜不同部位对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响

结果如图2所示。在灌胃后45min时,尼古丁组小鼠血清乙酰胆碱含量高出空白组30%,与2.2结果相近,说明小鼠已中毒。与尼古丁组相比,在灌胃后45min时,苦菜叶组和苦菜根组小鼠乙酰胆碱含量明显降低,但高于空白组。方差分析结果表明苦菜叶组和苦菜根组与尼古丁组小鼠血清乙酰胆碱含量之间有显著性差异(p<0.05),且苦菜叶组和苦菜根组与空白组小鼠血清乙酰胆碱含量之间有显著性差异(p<0.05),苦菜根组与苦菜叶组之间无显著性差异(p>0.05)。实验结果表明苦菜的根和叶都对尼古丁中毒小鼠出现的血清乙酰胆碱含量升高有一定抑制作用。

图2 苦菜不同部位对尼古丁中毒 小鼠血清乙酰胆碱含量的影响 Fig.2 The effect of different part of Ieris chinxensis(Thunb.) Nakai on serum acetylcholine content in mouse

2.4 苦菜提取物对尼古丁中毒小鼠血清乙酰胆碱含量的影响

结果如图3所示。在灌胃后45min时,尼古丁组小鼠血清乙酰胆碱含量高出空白组35%,与2.2和2.3结果相近,说明小鼠已中毒。与尼古丁组相比,在灌胃后45min时,苦菜干提物组和鲜提物组小鼠血清乙酰胆碱含量明显降低,但高于空白组。方差分析结果表明苦菜干提物组和苦菜鲜提物组与尼古丁组小鼠血清乙酰胆碱含量之间有显著性差异(p<0.05),且苦菜干提取物组和苦菜鲜提取物组组与空白组小鼠血清乙酰胆碱含量之间有显著性差异(p<0.05),苦菜干提取物组和苦菜鲜提取物组之间无显著性差异(p>0.05)。实验结果表明干苦菜提取物和鲜苦菜提取物都对尼古丁中毒小鼠出现的血清乙酰胆碱含量升高有一定抑制作用。

图3 苦菜提取物对尼古丁中毒 小鼠血清乙酰胆碱含量的影响 Fig.3 The effect of extractive from Ieris chinxensis(Thunb.) Nakai on serum acetylcholine content in mouse

3 结论

尼古丁可引起机体乙酰胆碱释放增加[10],继而出现中毒症状。当机体受尼古丁作用时,可引起支配横纹肌的运动神经末梢和交感神经节前纤维(包括支配肾上腺髓质的交感神经)等胆碱能神经发生兴奋,但乙酰胆碱蓄积过多时,则将转为麻痹,具体表现为肌纤维性震颤,血压上升,肌紧张度减退(特别是呼吸肌)、脉搏频数减少等。这与本实验中尼古丁中毒症状观察结果相符。

赵云玲等[7]以存活率为指标,证明苦菜作成的口服制剂,对烟碱中毒家兔和小白鼠口服应用具有明显的解救作用,许光鸿[8]通过牛、猪、狗的尼古丁中毒病例说明用苦菜治疗动物烟碱中毒可取得较好的效果。本研究与其不同之处在于用小鼠血清乙酰胆碱含量为指标评价了苦菜对尼古丁中毒的解毒作用,实验中小鼠中毒而未死亡,为研究苦菜对尼古丁慢性中毒的影响提供一定参考,而且比较了苦菜根和叶的解毒作用,针对有效成分易被破坏的问题,尝试了真空冷冻干燥苦菜,效果良好,为以后的苦菜研究以及苦菜的开发利用奠定了一定的基础。

本研究结果表明,尼古丁中毒小鼠灌胃苦菜及其提取物后,血清乙酰胆碱含量显著降低,表明苦菜可拮抗尼古丁对小鼠毒性,且有效成分存在于苦菜全株各部分,真空冷冻干燥可以很好保存苦菜的有效成分,有效成分可用60%乙醇溶液提取。但是,结果还显示各样品组血清乙酰胆碱含量与空白组仍明显偏高,说明苦菜对急性尼古丁中毒动物的解毒能力有限。因此,本研究结果提示苦菜对尼古丁急性中毒有一定的拮抗作用。但究竟是苦菜中的何种成分在起作用,作用机理如何,都还需要进行深入研究。而且,苦菜是否可对尼古丁上瘾进行干预,也将是我们下一步研究内容。

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