纳他霉素对葡萄采后交链孢菌的抑制作用

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(国家农产品保鲜工程技术研究中心,天津农产品采后生理与贮藏保鲜重点实验室,天津 300384)

交链孢菌(Alternariasp.)是引起鲜食葡萄采后腐烂变质的主要病原菌,尤其在低温冷藏及货架销售过程中发病严重,造成巨大的经济损失。研发科学、安全的葡萄采后交链孢菌抑制剂已经成为解决鲜食葡萄采后保鲜问题的关键手段之一[1]。

纳他霉素(Natamycin)是纳他尔链霉菌(Strepto-mycin natalensis)经发酵得到的一种多烯大环内酯类抗真菌剂,能有效抑制霉菌和酵母菌的生长[2-3]。在急性毒性、亚慢性毒性实验中均证明纳他霉素对动物无损害[3],是美国食品和药物管理局(FDA)正式批准的2种生物防腐剂之一,已成为许多国家广泛使用的一种天然生物源食品防腐剂和抗菌添加剂[4],我国卫生部也正式批准纳他霉素作为食品防腐剂[5]。目前,纳他霉素应用研究多集中在食品和医药领域[6],纳他霉素已在甜樱桃、草莓、冬枣、葡萄和芦笋等果蔬保鲜上有所应用[7-10],但没有应用于葡萄采后交链孢菌的防腐保鲜的研究。因此,本实验通过研究纳他霉素对鲜食葡萄采后交链孢菌的抑制作用,初步明确其抑菌效果及防病效果,希望为新型葡萄生物保鲜剂的开发提供切实的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

葡萄试材 于2012年9月采自天津滨海茶淀葡萄科技园,采收前未使用化学杀菌剂;供试菌从贮藏期内发病葡萄果实上分离得到,依据方中达[11]方法进行室内分离、纯化,培养后反接到葡萄上,待发病后再分离、纯化培养,经形态结构鉴定和显微观察证实为交链孢菌(Alternariasp.)[12]。

表1 不同浓度纳他霉素对葡萄交链孢菌菌丝生长量的影响(cm)Table 1 Effect of natamycin on hypha growth rate of grape Alternaria in different concentrations(cm)

95%的纳他霉素(Natamycin)原粉 由北京东方瑞德生物技术公司提供;药剂配制参照《农药室内生物测定实验准则》[13];纳他霉素用0.1mol/L盐酸无菌水溶液配成10000mg/L的母液,在4℃冰箱中保存备用。

电子天平BP210S 德国Sartorious;显微镜BX51 日本Olympus公司;超净工作台SW-CJ-1FD 苏州苏洁净化设备公司;智能型生化培养箱SPX-250B 上海琅玕实验室设备有限公司。

1.2 处理及方法

1.2.1 不同浓度纳他霉素对葡萄交链孢菌菌丝生长的抑制作用 实验前,将含0.01%吐温-80的0.1mol/L盐酸无菌水溶液进行菌培养作为预实验,实验证明此处理对菌生长无影响,因此,以此作为对照(CK)。实验处理参照菌丝生长速率法[14],将母液使用含0.01%吐温-80的0.1mol/L盐酸无菌水溶液分别稀释为浓度50、100、150、200mg/L备用。每个浓度设3个重复,25℃下培养1d 后,每天测量一次菌落直径,采用十字交叉法测量菌落扩展直径,连续测定7d;分别求出各处理浓度对菌落的抑制率,用DPS统计软件求出毒力回归方程及EC50值[15]。

抑制生长率(%)=(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径)×100

1.2.2 不同浓度纳他霉素对葡萄交链孢菌孢子萌发率的抑制作用 采用悬滴法[16]测定,药剂配制同1.2.1。以等量含0.01%吐温-80的0.1mol/L盐酸无菌水溶液为对照,12h后镜检孢子萌发率,以孢子芽管的长度超过孢子直径长度的一半作为已经萌发的孢子。每个处理重复3次,各重复在显微镜下检测100个以上的孢子囊,计算校正孢子萌发抑制率。用DPS统计软件求出毒力回归方程及EC50值[14]。

孢子萌发率(%)=孢子萌发数/调查孢子总数×100

孢子萌发抑制率(%)=(1-药剂处理的孢子萌发率/对照的孢子萌发率)×100

1.2.3 不同浓度纳他霉素对活体接种果实葡萄交链孢的防效评价

1.2.3.1 无损伤接种 先将 PDA 上纯化的交链孢菌配成浓度为 1×106个/mL的孢子悬浮液,再挑选大小整齐、无损伤的带柄玫瑰香葡萄果粒先在0、50、150、150、200mg/L的抑菌液中浸泡30s,再放入上述交链孢菌孢子悬浮液中浸果2min,取出自然晾干后装入PE袋中,扎紧袋口,恒温箱(25±2)℃下贮藏,空白对照采用含0.01吐温-80的0.1mol/L盐酸无菌水浸果。每处理 50个果实,设3个重复,5d后观察发病情况。

1.2.3.2 损伤接种 孢子悬浮液配制同上,用直径2mm 的灭菌铁钉在经体积分数70%乙醇表面消毒的葡萄果实中部分别刺孔2个,深度为4mm,然后用微量注射器吸取10μL 孢子悬浮液注入刺口处,接种后的果实经1h后放入抑菌液中浸泡30s,取出自然晾干后装入PE袋中,扎紧袋口,恒温箱(25±2)℃下贮藏,观察5d的病斑直径变化情况,用十字交叉法测量病斑直径。空白对照采用0.1mol/L盐酸盐酸无菌水浸果。每处理 50个果实,设3个重复。

1.3 数据统计分析

文中所用数据均采用Excel 2003转化为折线图,采用DPS 7.05统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度纳他霉素抑菌液对葡萄采后交链孢菌菌丝生长的影响

随着培养时间的延长,各处理菌丝生长量都呈上升的趋势。培养至第7d各处理菌落生长情况如表1所示,CK处理的菌丝生长量显著(p<0.05)高于其他纳他霉素处理,且随着纳他霉素浓度增大,菌丝生长量逐渐减小。

2.2 不同浓度纳他霉素抑菌液对葡萄采后交链孢菌菌丝生长抑制率的影响

从图1可知,从接种后第3d开始,随着处理浓度的增加,纳他霉素对葡萄采后交连孢菌的抑菌率逐渐增大;从接种后2～7d,200mg/L的抑菌液处理对菌丝生长的抑制率均大于80%,依次为82.15%、86.11%、87.37%、88.61%、88.72%和89.96%,其他3个浓度的抑菌液对菌丝生长的抑制率也在56.35%～81.67%之间。通过计算得到抑制毒力方程为Y=16.701+0.3989X(X代表纳他霉素抑菌液浓度,Y代表菌丝生长抑制率),R2=0.8454。EC50为83.48mg/L。由此说明,200mg/L纳他霉素对葡萄交链孢菌菌丝生长有很好的抑制作用。

图1 不同浓度纳他霉素 对葡萄交链孢菌菌丝生长抑制效果 Fig.1 The inhibitory effects of natamycin on mycelial growth of grape Alternaria in different concentrations

2.3 不同浓度下纳他霉素对葡萄交链孢孢子萌发的影响

由图2可知,不同浓度药剂对葡萄交链孢孢子萌发均有抑制作用,萌发率均随浓度的升高而减小,抑制萌发率则随浓度的升高而增大;50、100、150和200mg/L纳他霉素的孢子萌发率分别是CK的0.56、0.48、0.30和0.15,抑制萌发率分别达到了43.87%、51.82%、70.36%和85.41%,各浓度纳他霉素处理的孢子萌发率和抑制萌发率均达到差异显著水平(p<0.05)。通过计算得到纳他霉素抑菌液对葡萄采后交链孢菌孢子萌发的抑制毒力方程为Y=82.774-0.3663X(X代表纳他霉素抑菌液浓度,Y代表孢子萌发率),R2=0.925。 EC50为89.47mg/L,与抑制菌丝生长EC50值相接近。

图2 不同浓度下纳他霉素对葡萄交链孢孢子萌发的影响 Fig.2 Effects of natamycin on spore germination of grape Alternaria in different concentrations

2.4 不同浓度纳他霉素对葡萄交链孢菌发病率的防效评价

由图3可知,对于无伤接种培养5d的葡萄果实,随着纳他霉素浓度的增加葡萄交链孢菌引起的腐烂发病率逐渐减小,各处理间差异达极显著水平(p<0.01),与对照相比200mg/L纳他霉素处理发病率降低了41.18%。对于有伤接种的葡萄果实,随着培养时间的延长,交链孢菌病斑直径逐渐增大,且纳他霉素的防病效果越来越显著;培养1～3d时,纳他霉素各处理病斑直径均显著小于对照,但各处理间差异不显著(p<0.05);培养超过3d后,不同浓度纳他霉素处理间差异逐渐明显,其中200mg/L的纳他霉素处理病斑直径显著(p<0.05)小于其他各处理。

图3 不同浓度下纳他霉素 对葡萄交链孢霉发病率的防效评价 Fig.3 Preventing effect evaluation of natamycin on incidence of grape Alternaria in different concentrations

3 结论与讨论

有研究表明,纳他霉素几乎对所有真菌具有抑制和杀灭活性,能有效地抑制酵母菌和霉菌的生长,阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成[17]。绝大多数霉菌在纳他霉素浓度为0.5～6mg/kg时即被抑制,极个别菌种在10～25mg/kg时被抑制,多数酵母菌在1.0～5.0mg/kg时即被抑制[18]。本文研究结果表明,纳他霉素对所试葡萄交链孢菌有较强的抑制作用,可以有效抑制交链孢菌菌丝生长和孢子萌发,而且随着纳他霉素浓度的升高,对葡萄交链孢菌的抑制活性也随之提高。同时,适宜浓度纳他霉素对于葡萄交链孢菌引起的采后腐烂具有较好的预防效果。这也在一定程度上再次验证了前人的研究结论。

适宜浓度纳他霉素对由交链孢菌引起的葡萄采后腐烂具有较好的预防作用,本实验中当抑菌液浓度达200mg/L时,对菌丝生长和孢子萌发的抑制率均达到80%以上,且活体接种实验的抑菌效果也显著,具有高效、无毒[17]、低残留[19]等优点。因此,可以研制开发适用于葡萄采前喷施的生物绿色防腐保鲜剂,从而有效控制交链孢霉的潜伏侵染及采后发病;此外,由于不同浓度纳他霉素对葡萄交链孢菌抑菌效果存在差异,故在选择纳他霉素防腐剂用量时要注意合理使用浓度,达到最佳和最经济防腐效果,尽可能延长葡萄的保鲜期。

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