应用两种Ⅳ型胶原α5抗体诊断Alport综合征的比较

张明超　曾彩虹

Alport综合征(AS)是以血尿、感音神经性耳聋及进行性肾功能减退为临床特点的遗传性肾脏疾病。目前国内外诊断该病常根据临床特点、家族史、肾活检标本电镜检查、遗传学诊断及免疫组织化学诊断等方法[1-3]。该病发病机制是编码Ⅳ型胶原α链基因突变导致基膜损伤。其中采用抗Ⅳ型胶原不同α链单克隆抗体,对肾活检及皮肤活检组织行免疫荧光染色,对X连锁型AS患者的诊断、基因携带者的筛查及遗传型的判断有重要价值[ 4-6]。虽然越来越多的证据表明Ⅳ型胶原α5链正常也不能排除遗传性肾脏疾病的可能，但是Ⅳ型胶原α5链异常仍然是诊断遗传性肾脏疾病的重要手段。目前，市场上有两个公司提供检测Ⅳ型胶原α5链抗原，既往研究也以这两家公司的抗体为主，我们的目的是检验和比较Cosmo公司与Wieslab公司Ⅳ型胶原α5抗体在AS患者肾组织及皮肤组织的染色差异，为实际工作提供帮助。

材料和方法

肾活检和皮肤活检选择2013年1～3月在南京军区南京总医院肾脏科住院行肾活检的患者26例，所有患者肾脏冰冻组织均行Ⅳ型胶原α5链染色，其中15例患者同时接受皮肤活检，皮肤组织行石蜡包埋。所有标本利用两家公司的抗体平行比较，单克隆鼠抗人Ⅳ型胶原α5抗体(Wieslab 克隆号ALP105)用间接免疫荧光法，单克隆鼠抗人Ⅳ型胶原α5抗体(Cosmo BioUSA 克隆号CFT-45325)用直接免疫荧光法。

Wieslab间接免疫荧光法3 μm冰冻切片，吹干30 min，PBS冲洗10 min，单克隆鼠抗人Ⅳ型胶原α5抗体(Wieslab克隆号ALP105)1∶40，室温孵育2h，PBS冲洗5 min，切片滴加FITC标记的兔抗鼠免疫球蛋白IgG(Dako)，室温孵育30 min，水洗，干燥，水性甘油封片。

Cosmo直接免疫荧光法3 μm冰冻切片，吹干30 min，PBS冲洗10 min，单克隆鼠抗人Ⅳ型胶原α5抗体(Cosmo BioUSA 克隆号CFT-45325)1∶40，室温孵育2h，水洗，干燥，水性甘油封片。

皮肤石蜡切片染色新鲜皮肤组织固定于丙酮-氯仿液中，固定>12h，浸蜡，包埋，切片，石蜡包埋，3 μm切片，60℃烤片2h，二甲苯脱蜡，丙酮脱水，干燥，0.5%的胰酶消化8 min，尿素处理10 min，分别滴加一抗(Wieslab 克隆号ALP105 和Cosmo BioUSA克隆号CFT-45325)均按照1∶10稀释，Wieslab利用间接免疫荧光法， Cosmo BioUSA利用直接免疫荧光法。

结果判断肾组织中肾小球基膜(GBM)染色强度正常为2+，节段缺失或减弱为1+，完全缺失为0，400倍视野下观察肾小管基膜(TBM)数量正常为2+，减少或减弱为1+，完全无为0，肾小球包囊正常为2+，节段缺失或减弱为1+，完全缺失为0，皮肤组织染色基膜正常为2+，节段缺失为1+，完全缺失为0。

统计学方法检测数据采用SPSS 17.0统计软件处理，等级资料用中位数(25%分位数～75%分位数表示)，组间比较采用配对秩和检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结　　果

两种抗体在肾组织及皮肤组织染色结果见表1。

利用Wieslab公司Ⅳ型胶原α5抗体间接免疫荧光法染色，26例肾活检冰冻组织中GBM 4例完全缺失，2例节段缺失，20例正常；TBM 3例无，4例减少，19例正常；包囊2例完全缺失，4例节段缺失，2例减弱，18例正常。15例皮肤石蜡组织，6例完全缺失，1例节段缺失，8例正常。

利用Cosmo BioUSA公司Ⅳ型胶原α5抗体直接免疫荧光法染色，26例肾活检冰冻组织中GBM 4例完全缺失，4例节段缺失，1例减弱，17例正常；TBM 3例无，3例减少，20例正常；包囊2例完全缺失，5例节段缺失，2例减弱，17例正常。15例皮肤石蜡组织，6例完全缺失，6例节段缺失，3例正常。

肾脏冰冻组织中，利用两家公司对GBM染色发现，第20、22例染色不一致，Wieslab公司染色GBM正常，Cosmo BioUSA公司染色可疑节段缺失(图1)，经电镜证实这两例病例非遗传性肾脏疾病，第26例染色强度不一，但统计学无差异，对诊断结果无影响。第3、20、21例TBM数量不一(图2)，由于TBM数目缺乏统一标准，判断减少较难，统计学无差异，对于诊断结果无影响。第24包囊不一致(图3)，但无统计学差异，对于诊断结果亦无影响。15例皮肤石蜡组织中第2、8、11、21、23例不一致，Wieslab公司Ⅳ型胶原α5抗体染色均为正常，而Cosmo BioUSA公司Ⅳ型胶原α5抗体染色均节段缺失(图4)，两者有统计学差异(P=0.031)。26例肾组织中GBM 1例强度不一致，2例分布不一致，TBM强度 3例不一致，包囊1例分布不一致。15里皮肤组织染色中5例分布不一致。

表1　应用不同抗体对肾组织及皮肤组织行Ⅳ型胶原α5染色情况

图1　同一患者的肾组织Ⅳ型胶原α5染色，Wieslab公司抗体(A)肾小球基膜正常表达(↑)，Cosmo BioUSA 公司抗体(B)肾小球基膜节段减弱(↑)(IF，×400)

图2　同一患者的肾组织Ⅳ型胶原α5染色，Cosmo BioUSA公司抗体(A)和Wieslab公司抗体(B)肾小管基膜数量(IF，×400)

图3　同一患者的肾组织Ⅳ型胶原α5染色，Wieslab公司抗体(A)肾小球包囊正常表达(↑)，Cosmo BioUSA公司抗体(B)包囊节段表达(↑)(IF，×400)

图4　同一患者的皮肤组织Ⅳ型胶原α5染色，Wieslab公司抗体(A)基膜正常表达，Cosmo BioUSA公司抗体(B)节段表达且减弱(IF，×200)

讨　　论

Ⅳ型胶原分子是由3条α链拧成的三螺旋结构蛋白。Ⅳ型胶原分子各α链在皮肤和肾组织中的侧重表达不同,在皮肤组织中,α5α5α6三螺旋分子在表皮基膜呈线状表达,皮肤组织中无α3及α4链表达,在肾组织中,α3α4α5三螺旋分子存在于GBM、包囊、远端肾小管及集合管基膜,α5α5α6三螺旋分子仅表达于包囊、远端肾小管及集合管基膜[7-9]。正常人皮肤基膜是连续表达的。在遗传性肾脏疾病中，尤其AS患者中α5链在GBM中表达减弱、缺失或完全缺失，包囊正常或缺失，TBM减少或缺失；皮肤节段缺失或完全缺失。这对于AS诊断起了很大的作用。近年来，对遗传性肾脏疾病认识不断加深，通过检测皮肤基膜Ⅳ型胶原α5链，亦能够确诊大多数AS患者[10-13]。

利用Cosmo BioUSA公司Ⅳ型胶原α5抗体染色发现1例肾小球包囊壁节段缺失，该患者共2个肾小球，1个正常，而Wieslab公司Ⅳ型胶原α5抗体染色均正常，可能是切片原因，所以诊断时需综合判断。对于TBM数目的判断较难，其与切片影响很大。总体发现，Wieslab公司Ⅳ型胶原α5抗体间接免疫荧光法染色更加敏感，总体染色强度稍强，可能是间接法比直接法放大了信号，但在肾组织中染色结果无统计学差异，对诊断结果无影响。如果能接受染色强度的差异，Cosmo BioUSA公司Ⅳ型胶原α5抗体直接免疫荧光法染色，更加特异，更省时间。皮肤组织Ⅳ型胶原α5染色较困难，技术要求高，首先是新鲜组织放入丙酮和氯仿的混合固定液中固定12h，然后进行浸蜡，包埋，切片，需要二甲苯脱蜡，丙酮脱水，干燥，均与常规石蜡标本处理不同，在Wieslab试剂盒中有针对皮肤组织染色的尿素试剂，需要胰酶和尿素两步处理，染色结果比较理想。而Cosmo BioUSA公司Ⅳ型胶原α5抗体试剂盒无尿素处理试剂，其产品说明书表明皮肤染色不是很准确，染色强度比较弱，我们利用同Wieslab试剂盒同样的方法处理皮肤，虽然部分标本染色取得很好的结果，但总体不理想。

图5　Cosmo BioUSA公司抗体Ⅳ型胶原α5染色。A：正常新鲜冰冻肾组织切片；B：-20℃放置3月后冰冻肾组织切片(IF，×400)

另外，我们发现一个有趣的现象，取一部分冰冻切片置于-20℃冰箱3月后，取出吹干，按照同样操作步骤发现，Wieslab试剂盒的Ⅳ型胶原α5抗体染色结果无较大变化，而Cosmo BioUSA公司Ⅳ型胶原α5抗体较多染色减弱，甚至出现阴性结果(图5)，而从-70℃冰箱的包埋组织切片后染色，两公司抗体染色均可取得较好的结果，且无明显差异。我们认为，以冰冻组织包埋保存在-70℃冰箱较为合适。对于皮肤石蜡组织，我们分别调取1、3、6月的正常皮肤石蜡组织发现，Wieslab试剂盒的Ⅳ型胶原α5抗体染色分别为正常、减弱或节段缺失； Cosmo BioUSA公司Ⅳ型胶原α5抗体染色分别为正常、减弱、节段缺失或阴性(图6)。可能由于皮肤组织固定剂的原因，不能很好的保存抗原，但对于其他能很好保存抗原的固定剂，Ⅳ型胶原α5抗体无法进行染色。为此对于皮肤组织进行Ⅳ型胶原α5染色的时候尽可能选择1月内的阳性标本作为对照。我们保存方法是否有问题，有待进一步研究分析。

图6　皮肤石蜡组织Cosmo Biousa公司抗体Ⅳ型胶原α5染色(IF，×400)

电镜是诊断AS的金标准，AS在电镜下有其特征性的表现，GBM广泛厚薄不一及致密层分裂，免疫荧光染色和电镜的结合是诊断遗传性肾脏疾病的必要条件[14-15]，Ⅳ型胶原α5染色结果和电镜结果应一致。本组26例患者经电镜证实7例为AS，与利用Wieslab试剂盒的Ⅳ型胶原α5抗体染色结果完全一致。我们利用两种方法和两种抗体对肾组织和皮肤组织进行染色，虽然肾组织染色结果无太大差别，但是在皮肤组织中差异较大，根据光镜和电镜判断6例患者并非AS，由此说明该抗体不适应皮肤组织染色。总之，两家公司抗体在肾组织染色中发现只存在强度上的差异，在阳性和阴性间无差异，对诊断无影响；而在皮肤组织中有较大差异，Wieslab公司更加可靠，可能的原因是直接法不够敏感，对于节段性病变不能准确反映。

小结：Wieslab试剂盒的Ⅳ型胶原α5抗体是目前唯一通过论证的诊断试剂盒，价格比较昂贵，是Cosmo BioUSA公司试剂盒价格的两倍，且由于Wieslab试剂盒用量比较大，目前已出现全球断货1年。对于肾组织染色，Cosmo公司的Ⅳ型胶原α5抗体可代替Wieslab公司试剂盒抗体，Cosmo BioUSA公司试剂盒是直接法，操作简单、省时、经济，但对于皮肤石蜡组织，Cosmo BioUSA公司试剂盒染色结果较差，不可替代Wieslab公司试剂盒。

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