巨噬细胞活化表型与肾脏疾病

郭银凤　综述　张晓良　审校

巨噬细胞在肾脏疾病中既发挥促炎和组织损伤作用，同时还控制炎症反应，参与组织修复。巨噬细胞这种“双重作用”与其不同的活化状态密切相关，而不同的活化状态最终决定肾脏疾病的发展方向。本文就巨噬细胞的活化状态、其在肾脏疾病中的作用及如何通过调节巨噬细胞功能来治疗肾脏疾病进行综述。

巨噬细胞的表型和功能

生理状态下，巨噬细胞不仅能够吞噬、杀灭和清除病原体及异物，还能加工和提呈抗原，启动免疫应答反应，在维持组织的稳态方面发挥重要作用。Martinez等[1]发现，巨噬细胞具有显著的异质性，在特定微环境中分化并获得两种独立的活化表型，即经典活化巨噬细胞(CAMs或M1)和非经典活化巨噬细胞(AAMs或M2)。

M1由Th1淋巴因子干扰素γ(IFN-γ)和Toll样受体(TLRs)结合的微生物产物，如脂多糖(LPS)、胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸DNA片段(CpGDNA)或细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1(IL-1)等诱导。M1除吞噬异物及细菌、参与宿主免疫防御反应外，还可分泌促炎因子(IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α)、趋化因子[单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-8]、活化氧(ROS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等促进炎症反应。同时M1高表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ类分子和共刺激分子CD86，启动Th1型免疫反应，高效杀灭细菌、胞内病原体和肿瘤细胞。但这些因子也会损伤周围正常组织。因此，M1被认为一种促炎、促损伤的巨噬细胞表型。

M2由Th2淋巴因子IL-4、IL-10、1L-13和转化生长因子β(TGF-β)、糖皮质激素或吞噬凋亡细胞的过程所诱导。M2分泌大量IL-10和IL-lRA，抑制IL-12、IL-1、TNF-α的产生，抑制炎症反应。M2高表达精氨酸酶1(Arg1)，与iNOS竞争水解底物精氨酸，抑制NO生成，从而抑制由iNOS介导的免疫杀伤作用，发挥免疫抑制功能；Arg的产生还能诱导多胺和脯氨酸的合成，进而促进胶原的合成及组织修复。同时，M2高表达某些表面标志分子，如甘露糖受体(MR)、清道夫受体(SR)、类几丁质酶3样分子3(YM-1)以及炎症相关的缺氧诱导有丝分裂因子(FIZZ1)，这些特异性蛋白的表达可作为判定巨噬细胞是否发生非经典活化的标志。M2还可被细分为IL-4或IL-13诱导的M2a型，免疫复合物诱导的M2b型及IL-10、TGF-β或糖皮质激素等诱导的M2c型。M2能抑制炎症反应，促进血管生成，参与组织修复与重塑。

M1/M2是巨噬细胞表型分化的两个极端。在体内，巨噬细胞在同一瞬间同时接触多种微环境信号。因此，巨噬细胞在体内表型的极化比体外某单一因子刺激而发生的极化过程更为复杂。不同表型的巨噬细胞可共存于同一组织，而巨噬细胞也可同时表达M1和M2标志物。在某些条件下，极化的M1与M2也可发生相互转化[2]。

巨噬细胞这种异质性存在的可能机制主要有两方面：(1)巨噬细胞对于周围环境不同刺激具有可塑性；(2)循环中的单核细胞本身具有两种不同的表型。巨噬细胞主要来源于循环中的单核细胞。研究发现，单核细胞并非一群表型单一的细胞，其表面分子表达谱有其多样性[3]。人类单核细胞分为CD16-和CD16+细胞。鼠类单核细胞根据其细胞表面分子Ly6C表达的差异分为Ly6C-CCR2lowCX3CR1high和Ly6C+CCR2highCX3CR1low细胞。前者倾向于移居正常组织，具有较长的寿命，称作固有单核细胞。后者主要迁移至局部炎症组织，促进炎症反应，称为炎性单核细胞。单核细胞的亚型是巨噬细胞不同表型形成的重要因素之一。在小鼠急性心肌缺血模型中，早期即有高表达Ly6C+巨噬细胞浸润，该细胞释放TNF-α，清除细胞残骸；随后，Ly6C-单核细胞通过表面受体CX3CR1募集至受损心肌组织，表达血管内皮生长因子(VEGF)，促进肌成纤维细胞生成、胶原沉积及血管新生[4]。因此，一般认为Ly6C+单核细胞是M1的前体，而Ly6C-单核细胞是M2的前体[5]。近来，Jenkins等[6]确定巨噬细胞自我增生的新机制。这一发现打破了此前关于巨噬细胞来自循环中单核细胞的传统观点，提出在Th2型炎症反应中，M2来自于组织固有巨噬细胞增殖的新认识。因此，巨噬细胞的来源对于其表型和功能具有重要的意义。

巨噬细胞与肾脏疾病

肾小球和肾间质内巨噬细胞浸润是多种急性肾损伤和慢性进展性肾脏疾病的重要病理特征。在各种肾脏疾病的临床研究中发现，巨噬细胞在肾组织的浸润程度与肾脏组织学的损害、蛋白尿的程度、肾功能的减退及其预后密切相关[7]。

在糖尿病肾病(DN)研究中，肾组织巨噬细胞浸润与活化和蛋白尿程度、肾功能减退及肾脏纤维化呈正相关[8]，阻断巨噬细胞浸润能显著减少蛋白尿，减轻肾小球硬化[9]。巨噬细胞在阿霉素肾病(AN)进展中也发挥重要作用。Wyburn等[10]利用中和抗体拮抗巨噬细胞释放的IL-18，明显减少AN大鼠蛋白尿水平，改善肾功能，减轻肾小球硬化及间质炎症反应。在抗肾小球基膜(GBM)肾炎中，肾组织中浸润的巨噬细胞通过释放大量炎症因子促进肾脏损伤，给予C-fms抑制剂能阻断肾组织巨噬细胞的浸润与活化，减少新月体形成，减轻肾小球硬化[11]。一系列经典的巨噬细胞耗竭实验和补充实验进一步证实了巨噬细胞在肾脏疾病中的致病作用。在小鼠缺血再灌注损伤(IRI)模型中，Lee等[12]在IRI前利用氯膦酸二钠脂质体耗竭循环中的单核巨噬细胞后，显著减少肾小管上皮细胞凋亡，减轻肾小管萎缩；而补充用IFN-γ预处理过的骨髓源性巨噬细胞(BMDM)能再次诱发肾脏损伤，且其损伤的严重程度与未耗竭巨噬细胞的IRI小鼠损伤程度一样严重[12]。这些研究从正反两方面均提示，巨噬细胞参与多种肾脏疾病的发生与发展。

巨噬细胞浸润在肾脏炎症与纤维化中的作用

肾脏损伤后，巨噬细胞迅速募集至肾小球或肾间质，吞噬残骸和凋亡细胞，发挥免疫防御作用。但持续的肾脏损伤会导致巨噬细胞持续浸润，产生大量炎症因子与生长因子，最终导致肾组织正常结构的破坏和不可逆的纤维化[13]。因此，理解巨噬细胞在肾脏炎症和纤维化过程中的作用机制至关重要。

在各种肾脏疾病中，肾小球与肾小管的损伤及持续的蛋白尿促进巨噬细胞的浸润。浸润的巨噬细胞产生大量的ROS、NO及促炎因子，直接损伤肾小球和肾小管，导致组织结构破坏和功能丧失。巨噬细胞本身能释放大量的促纤维化因子TGF-β和基质降解酶抑制剂，促进细胞外基质的合成与沉积，从而导致肾小球硬化及肾间质纤维化。巨噬细胞还可通过旁分泌途径激活肌成纤维细胞或促进肾小管上皮细胞转分化为肌成纤维细胞，进而加速肾脏纤维化的发生与发展[14]。本课题组Zhang等[15]早期研究发现，肾组织浸润的单核巨噬细胞通过其表面CD18分子与肾小管上皮细胞表面细胞间黏附分子1(ICAM-1)分子交互作用，促发细胞内信号转导，诱导肾小管上皮细胞高表达TGF-β。因此，巨噬细胞在肾脏组织炎症和纤维化的发生、发展中发挥重要作用。

巨噬细胞对肾脏修复作用

随着对巨噬细胞的深入研究，目前认为巨噬细胞不仅介导组织损伤和纤维化进展，同时还参与损伤后的修复与重建。在大鼠肾脏IRI的修复阶段，利用脂质体(LC)耗竭循环中巨噬细胞后，肾小管上皮细胞增殖显著减少，组织修复过程明显延缓[12]。体外实验发现巨噬细胞能促进肾小管上皮细胞增生，其机制可能与Wnt7b有关[16]。在UUO小鼠，于第6天利用环磷酰胺耗竭循环中单核巨噬细胞，减少肾组织巨噬细胞浸润，14d后发现肾间质纤维化程度加重，而输注BMDM能减轻肾间质纤维化[17]。另外，体外刺激调节巨噬细胞功能后再输注体内，可以明显减轻多种肾脏疾病(包括肾小球肾炎、蛋白尿性肾病以及肾间质纤维化)损伤。研究表明，巨噬细胞的这种双重作用主要取决于巨噬细胞在所处微环境中所呈现的活化状态。

肾脏损伤中巨噬细胞的活化状态

巨噬细胞在不同类型的疾病及不同疾病阶段呈现不同的活化状态，分别参与组织损伤与修复过程。在DN中，肾组织浸润的巨噬细胞主要以M1为主，通过释放IL-1、TNF-α等炎症因子下调nephrin 和podocin的表达，直接损伤足细胞[18]。而肝细胞生长因子能促进骨髓源性M2巨噬细胞募集至糖尿病小鼠肾组织，该M2融合包囊上皮细胞，参与肾组织修复[19]。在大鼠肾脏IRI的早期阶段，巨噬细胞高表达iNOS，呈M1表型；而在修复阶段，巨噬细胞高表达Arg-1和MR，呈M2表型。进一步研究发现，在IRI早期耗竭巨噬细胞能减轻肾脏损伤；而在IRI修复阶段耗竭巨噬细胞，肾小管上皮细胞的增生与肾组织的修复过程明显延缓。体外研究发现M2可能通过分泌某些可溶性分子促进肾小管上皮细胞的增生[12]。在小鼠UUO术后10d解除梗阻，肾脏纤维化程度的减轻与巨噬细胞高表达CD206和CD204相关，后两者是M2的表面标志物[20]。在小鼠狼疮性肾炎模型中，浸润的巨噬细胞主要以促炎型M2b为主，而血清淀粉样P物质能介导巨噬细胞吞噬ALD-DNA，进而激活磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酶-苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)-细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路，促进M2b转化为抗炎性M2a，延缓狼疮肾炎的进展[21]。这些研究提示，不同组织微环境决定巨噬细胞的活化状态，而巨噬细胞的不同活化状态最终决定肾脏疾病的发展方向。M1主要介导肾脏炎症反应，而M2参与肾组织修复过程。然而，目前尚存在的难题是巨噬细胞浸润肾间质后促进修复且不伴纤维化的胞内信号机制及M2不同亚类的生物学效应及其作用机制仍然不清楚。

通过调节巨噬细胞功能防治肾脏纤维化研究进展

巨噬细胞的异质性及功能多样性使其在肾脏疾病的发生发展中具有双重作用。目前面临的挑战是如何通过调节巨噬细胞功能来对肾脏疾病进行治疗。M1由于其促炎和组织损伤作用而被认为是消除的靶点；而M2具有抗炎和组织修复功能，因而是肾脏疾病的潜在治疗手段。

巨噬细胞作为治疗靶点自1980年Holdsworth等[22]发现利用抗巨噬细胞血清耗竭巨噬细胞可减轻实验性肾小球肾炎后，研究者们试图利用各种手段来阻断组织中巨噬细胞浸润。在DN大鼠，CCR2拮抗剂或基因沉默能显著减少肾小球巨噬细胞浸润，减轻炎症反应，减少蛋白尿，同时减轻肾脏病理改变[23]。本课题组体外研究发现，地塞米松能显著抑制肾小管上皮细胞ICAM-1的表达进而阻断单核细胞黏附，抑制其诱导的肾小管上皮细胞转分化[24]。因此，阻断巨噬细胞浸润能减轻肾脏损伤，保护肾脏的结构与功能。Randolph等[25]提出在Th2型炎症反应中M2巨噬细胞来自于组织固有巨噬细胞增生的新认识。因此，阻断巨噬细胞的浸润可能只是减少了M1的数量，并不影响同一组织中M2的数量。

巨噬细胞作为治疗工具基于巨噬细胞的组织修复功能，许多研究试图探索通过体外调节巨噬细胞功能状态后，以其作为治疗工具来干预慢性肾脏病进展。该巨噬细胞可从血液、骨髓或脾脏中分离获得，经体外修饰后再注射至体内。目前相关的研究主要分为两大类： (1)通过转基因技术改变巨噬细胞功能后再输入；(2)通过体外保护性细胞因子调节巨噬细胞功能后再输入。

基因转染技术能使巨噬细胞高表达某种保护性基因。目前转染的保护基因有IL-10、IL-4、IL-1RA和IκB。这种巨噬细胞经肾动脉注射至肾病动物模型中，能特异性浸润至肾脏炎症病灶，促进组织修复，保护肾功能。Jung等[26]将高表达IL-10的BMDM 注射至IRI大鼠体内，上调修复因子Lcn-2表达，并抑制TNF-α、IL-1β和IFN-γ等释放，明显降低血尿素氮和肌酐，减轻肾脏损伤。Kluth等[27]将高表达IL-4的BMDM经单侧肾动脉注射至肾毒性肾病大鼠体内后，产生大量IL-4，显著减少肾小球巨噬细胞浸润，减轻炎症反应，减少尿蛋白，同时还能减轻对侧肾脏损伤。因此，通过基因水平调节巨噬细胞功能后，巨噬细胞高表达保护性因子，发挥抗炎和组织修复功能，但由于病毒载体的不安全性使其在临床上的运用受到限制。

Wang等[28]发现通过体外保护性细胞因子诱导的M2具有良好的表型稳定性(不管在体内还是体外，其表型均能维持4周之久)及优先定位至炎性病灶的特点，其肾保护作用已经在多种动物模型中得到证实。在链脲佐菌素(STZ)诱导的DN小鼠模型中，注入IL-4和IL-13诱导的M2a后，肾小球肥大、肾小管萎缩及间质纤维化的程度均明显下降[29]。在严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠AN模型中，注射IL-4和IL-13诱导的M2a，该M2a特异性优先定位至肾脏损伤病灶，减少肾组织巨噬细胞浸润，减少炎症因子的释放，减轻肾组织损伤，改善肾功能[28]。同样，注射IL-10和TGF-β诱导的M2c，显著减轻尿蛋白，增加肌酐清除率，同时肾小管萎缩及肾小球硬化程度也明显下降。有趣的是，M2c输入小鼠体内后，TGF-β释放反而减少，因而减轻了其潜在的致纤维化作用。M2保护作用机制可能有几方面：(1)M2能抑制CD4T细胞增生，减轻CD8T细胞的毒性作用；(2)M2能拮抗M1，减轻炎症反应；(3)M2c的肾保护作用优于M2a，这可能与M2c高表达调节性共刺激分子B7-H4及诱导T调节性细胞的生成有关[30]。

综上所述，体外保护性细胞因子诱导M2是一种相对简单、有效的方法，可治疗实验性炎性肾脏疾病。这一方法不但克服了基因转染技术的安全性问题，而且具有特异性、稳定性和高效性三大优点。但是，不同亚型的M2在不同类型肾脏疾病中的生物学效应及其作用机制仍未完全阐明。M2的体外培养技术、最佳的保护性诱导因子、注射剂量、注射时间和注射频率等参数还需要进一步的研究探索。本课题组最近的研究也初步发现，临床上常用的活性维生素D具有促进巨噬细胞M1向M2转化的作用，这一作用是通过激活过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)信号途径得以实现的(未发表资料)。另外我们还发现，中药冬虫夏草的多糖组分F1具有激活巨噬细胞M2表型的作用，这可能是虫草多糖肾保护作用的重要机制之一(未发表资料)。

展　　望

巨噬细胞具有多样性，既介导肾组织损伤，同时也能促进组织修复，这主要取决于巨噬细胞在所处微环境中所呈现的活化状态。不同活化状态的巨噬细胞具有不同的表型和功能。深入研究不同病理阶段中巨噬细胞的表型与功能及决定巨噬细胞活化状态的信号分子，通过调节巨噬细胞活化状态与功能，将成为治疗慢性肾脏病的一个新的富有潜力的领域。

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