Ni 胁迫对斜纹夜蛾幼虫包囊反应的影响

夏 嫱，孙虹霞，刘宏宇

(1.遵义医学院珠海校区/贵州省免疫学研究生教育创新基地，珠海 519041;2.中山大学有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广州 510275)

昆虫虽然缺乏获得性免疫系统，不能合成脊椎动物的免疫球蛋白(Lavine and Strand，2002)，但这种相对简单的免疫系统可使其成为环境污染的有效指示生物(Galloway and Depledge，2001)。随着重金属污染的日益严重，近年来国内外关于重金属污染对昆虫免疫反应影响得到极大关注。如Cd2+胁迫48-72 h 使棕尾别麻蝇Boettcherisca peregrina 幼虫血细胞包囊作用显著低于对照，Cd2+处理浓度达到150μg/g 时蛹的包囊率与对照相比显著降低(李艳敏等，2010);而Ni 浓度达50μg/g 时即可使大蜡螟Galleria mellonella 产生显著的免疫应答，并显著抑制其酚氧化酶的活性(Dubovskiy et al.，2011);重金属胁迫亦可使木蚁Formica aquilonia 及秋尺蠖Epirrita autumnata 产生免疫反应(Sorvari et al.，2007;van Ooik et al.，2007)。重金属对昆虫免疫反应影响与重金属的特性、胁迫时间、生物体的发育程度、基因型、性别及所选用的免疫参数有关(van Ooik et al.，2007)。包囊反应作为昆虫免疫反应的一个重要指标，在昆虫免疫学研究中被广泛应用。

由于工业生产中镍(Ni)的不合理排放、污水灌溉及含Ni 肥料的过量施用，越来越多的Ni 及其化合物进入农业土壤(罗丹等，2010;Amin et al.，2013)，造成土壤Ni 含量的超标(Cai et al.，2010;Li et al.，2012)。据广东省生态环境与土壤研究所2005年的报道，Ni 是珠江三角洲近40%农田土壤重金属污染的第二大污染物，其超标值最高可达59.3%。土壤中过量的Ni2+可在蔬菜中积累，对蔬菜产生毒害作用(Garrido et al.，2005)，从而对植食性昆虫产生影响。

斜纹夜蛾Spodoptera litura Fabricius 是农田重要的植食性害虫，对多种作物尤其是蔬菜产生严重危害。前期研究表明，饲料中Ni2+可在斜纹夜蛾幼虫体内积累(孙虹霞等，2008)，并对其血淋巴中能源物质(孙虹霞等，2010)、生长发育产生影响(Sun et al.，2007)。根据能量代谢、生长发育和免疫反应之间的“trade-off”原则，幼虫体内积累的Ni2+是否会对斜纹夜蛾幼虫的免疫应答产生影响?基于此，本文研究了斜纹夜蛾5、6 龄幼虫血细胞对凝胶珠的包囊率在120 h 内的变化情况，为研究重金属Ni 对斜纹夜蛾免疫功能的影响提供理论依据，并为全面研究Ni 胁迫对斜纹夜蛾的影响提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 斜纹夜蛾幼虫的饲养与Ni2+胁迫

斜纹夜蛾系中山大学昆虫学研究所养虫室提供，饲养条件为(26±1)℃，L∶D=16∶8，RH(75±5)%。在人工饲料中添加不同剂量Ni2+，并以此连续3 代饲喂斜纹夜蛾幼虫。以第1 代幼虫化蛹后羽化成虫所产的卵作为第2 代虫源，第3 代依此类推，每天更换饲料并连续胁迫3 代。

根据Cai 等(2010)的报道，珠三角地区如东莞农业土壤Ni 含量范围为2.29-57.46 mg/kg，Macnicol and Beckett(1985)及 Garridoe 等(2005)的研究表明蔬菜中Ni 含量可达30 mg/kg;而斜纹夜蛾寄主之一Raphanus sativus L.中积累的Ni 含量在3.28-66.67 mg/kg 之间(Xu et al.，2008)。此外，我们的预实验表明，当饲料中的Ni2+浓度高于50 mg/kg 时，第4 代成虫所产卵的孵化率极低。因此，根据上述研究基础，通过在人工饲料中添加不同浓度的NiCl26H2O，使饲料中Ni2+终浓度分别为1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg、20 mg/kg 和40 mg/kg。以不添加Ni2+饲料饲养的斜纹夜蛾幼虫为对照(记为0 mg/kg)。

1.2 包囊反应的检测

1.2.1 Sephadex G-25 葡聚糖凝胶珠的注射

Sephadex G-25 葡聚糖凝胶珠购于Pharmacia公司。苄基青霉素和链霉素购于Amersco 公司。参照文献Richardsand Parkinson(2000)方法，用0.1%的碱性品红将Sephadex G-25 葡聚糖凝胶珠染色过夜并置于紫外灯下自然晾干。使用时将凝胶珠溶于Pringle's 生理盐水中(苄基青霉素和链霉素的终浓度分别为1000 U/mL 和1 mg/mL)。

待幼虫进入5 龄后，每隔24 h 随机挑选各个处理长势均一的10 头幼虫进行实验，直至幼虫发育至6 龄末，分别记为0-24 h、24-48 h、48-72 h、72-96 h 及96-120 h 幼虫。注射前将幼虫冰上麻醉，然后用酒精棉球消毒虫体。微量毛细管从第三腹足将凝胶珠注射入虫体内。0-24 h 幼虫约注射20-25个凝胶珠，随着虫体的增大，注射的凝胶珠数目也逐渐增加，每次约增加8-12个凝胶珠，以保证不同发育期虫体包囊作用的稳定性。注射24 h 后解剖虫体，相差显微镜(Carl Zeiss)下观察凝胶珠的包囊情况。

1.2.2 包囊程度的分级

根据包囊的厚度对血细胞的包囊程度进行划分，每一类分别用渐次增加的数字表示。0 级:没有血细胞黏附或只有数个血细胞黏附;1 级:包囊厚度小于凝胶珠半径的1/2;2 级:包囊厚度大于凝胶珠半径的1/2，小于半径;3 级:包囊厚度大于凝胶珠半径。根据凝胶珠被包囊的面积对血细胞的包囊程度进行划分，每一类也分别用渐次增加的数字表示。0 级:没有血细胞黏附或只有数个血细胞黏附;1 级:包囊面积小于凝胶珠表面的1/2;2 级:包囊面积大于凝胶珠表面的1/2(Hu et al.，2003)。

每一时间点的包囊率为被包囊凝胶珠数占总凝胶珠数的比例。将2种分级方法中包囊类别均大于或等于2 的凝胶珠计为已包囊，其它的计为未包囊。

1.3 数据分析

不同发育阶段的5、6 龄幼虫血细胞对凝胶珠的包囊率经arcsin 转换后，进行ANOVA 单因素方差分析，若差异显著再经post hoc 多重分析(SAS8.1)，以阐明各处理间差异的显著性。同时，采用了两因素方差分析的PROC GLM 检验饲料中Ni2+剂量和胁迫世代数双因素对血细胞包囊率的影响。

2 结果与分析

2.1 斜纹夜蛾幼虫血细胞对Sephadex G-25 凝胶珠的包囊反应

不同Ni2+胁迫下斜纹夜蛾幼虫血细胞对Sephadex G-25 凝胶珠的包囊情况见图1。图1 中A、B 为0 级;C、D 为1 级;E、F 为2 级;G、H为3 级。

图1 斜纹夜蛾幼虫血细胞对Sephadex G-25 凝胶珠的包囊反应Fig.1 Encapsulation hemocytes of Sephadex G-25 beads in Spodoptera litura larvae.

2.2 Ni2+ 胁迫对斜纹夜蛾幼虫血细胞包囊率的影响

2.2.1 Ni2+胁迫对0-24 h 幼虫血细胞包囊率的影响

连续3 代0-24 h 幼虫血细胞对凝胶珠包囊率均在1 mg/kg 和5 mg/kg 胁迫浓度下高于对照(除1 mg/kg Ni2+胁迫下第2 代幼虫外，均显著高于对照);10 mg/kg 和20 mg/kg Ni2+胁迫的第2、3 代幼虫血细胞的包囊率均低于对照，但仅第3 代幼虫血细胞对凝胶珠的包囊率显著低于对照;40 mg/kg Ni2+胁迫下血细胞对凝胶珠的包囊率在各个世代均低于对照(图2)。说明此浓度已对斜纹夜蛾幼虫血细胞的免疫功能产生影响。

图2 取食含不同剂量Ni2+人工饲料的斜纹夜蛾0-24 h 幼虫血细胞的包囊率Fig.2 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 0-24 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.2 Ni2+胁迫对24-48 h 幼虫血细胞包囊率的影响

24-48 h 幼虫血细胞对凝胶珠的包囊率与0-24 h 的变化规律类似，但各处理幼虫与对照的差异性有所不同。经过连续3 代1 mg/kg 及5 mg/kg Ni2+胁迫幼虫血细胞的包囊率均显著高于对照，而在20 mg/kg 及以上处理浓度Ni2+胁迫的第2、3 代幼虫血细胞的包囊率则显著低于对照(图3)。这表明随胁迫时间增加，Ni2+对幼虫免疫抑制作用增强。

图3 取食含不同剂量Ni2+人工饲料的斜纹夜蛾24-48 h 幼虫血细胞的包囊率Fig.3 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 24-48 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.3 Ni2+胁迫对48-72 h 幼虫血细胞包囊率的影响

在48-72 h 内，第1、2、3 代1 mg/kg 和5 mg/kgNi2+胁迫下幼虫血细胞的包囊率均高于对照，第1、3 代在此处理浓度下包囊率与对照相比显著增加;20 mg/kg 以上Ni2+胁迫下连续3 代幼虫的包囊率均显著低于对照及5 mg/kg 以下Ni2+胁迫幼虫血细胞的包囊率(图4)。

图4 取食含不同剂量Ni2+人工饲料的斜纹夜蛾48-72 h 幼虫血细胞的包囊率Fig.4 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 48-72 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.4 Ni2+胁迫对72-96 h 幼虫血细胞包囊率的影响

72-96 h 时间段内1 mg/kg Ni2+胁迫下3个世代幼虫血细胞的包囊率与对照相比均增加，且第1、3 代显著增加;5 mg/kg 及以上Ni2+胁迫的第2、3代幼虫血细胞的包囊率均显著低于对照(图5)。

图5 取食含不同剂量Ni2+人工饲料的斜纹夜蛾72-96 h 幼虫血细胞的包囊率Fig.5 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 72-96 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.5 Ni2+胁迫对96-120h 幼虫血细胞包囊率的影响

在96-120 h 时间段内，第1 代幼虫血细胞的包囊率在1 mg/kg 及5 mg/kg 处理浓度下升高，处理浓度达到10 mg/kg 及以上时包囊率下降;第2、3 代各处理幼虫血细胞对凝胶珠的包囊率均显著低于对照，并随胁迫浓度的增加呈递减趋势，存在一定的剂量反应关系(图6)。这可能是随胁迫时间增加，Ni2+对斜纹夜蛾幼虫的免疫损坏程度增加，导致其免疫应答减弱。

图6 取食含不同剂量Ni2+饲料的斜纹夜蛾96-120 h 幼虫血细胞的包囊率Fig.6 Encapsulation rate of hemocytes at the period of 96-120 h from the beginning of the 5th instar Spodoptera litura larvae exposed to different nickel doses for 3 generations

2.2.6 Ni2+剂量和胁迫世代数对幼虫血细胞包囊率的交互影响

不同时间段幼虫对凝胶珠包囊率的两因素方差分析结果如表1 所示。结果表明，饲料中不同剂量的Ni2+与胁迫世代数对不同时间段幼虫的包囊率均产生显著影响。但是，饲料中不同Ni2+剂量以及胁迫世代数两因素未对24-48 h 以及48-72 h 幼虫的包囊率产生显著的交互影响，这说明幼虫包囊的形成是与胁迫时间长短及胁迫剂量双因素密切相关的。

表1 饲料中Ni2+剂量和胁迫世代数对斜纹夜蛾5 龄幼虫120 h 内包囊率交互影响的显著性检验P 值Table 1 P-values of effects of nickel doses in diet and stressing generations on encapsulation rate of the 5th instar larvae of Spodoptera litura exposed to different doses of nickel for 120 h

3 结论与讨论

昆虫通过包囊反应来清除血腔内的寄生蜂和外源寄生物，因此，包囊反应多与昆虫的免疫反应呈正相关性(Dubovskiy et al.，2011)。本研究结果显示，饲料中Ni2+的短期胁迫对斜纹夜蛾幼虫包囊反应的影响主要表现在低剂量(1 mg/kg、5 mg/kg)Ni2+促进而高剂量(40 mg/kg)Ni2+抑制的现象，这与Sorvari 等(2007)研究木蚁F.aquilonia 的免疫反应相类似，木蚁对重金属胁迫的免疫反应也存在低浓度促进而高浓度抑制的现象;而E.Autumnata 及G.mellonella 的免疫反应则随重金属处理浓度增加而增加(van Ooik et al.，2007;Dubovskiy et al.，2011)。

Ni2+对斜纹夜蛾幼虫免疫反应的影响与饲料中Ni2+的剂量、胁迫时间及幼虫的发育阶段相关联。对5 龄初幼虫而言，幼虫摄入的Ni2+含量较低，对体内Ni2+含量增加的敏感性较强，可迅速增加血细胞对凝胶珠的包囊率，以抵御过量Ni2+的危害;而随胁迫时间延长Ni2+的免疫毒性增强，血细胞的包囊形成能力降低。

第1 代各发育阶段幼虫及第2、3 代0-96 h幼虫的包囊反应均存在低剂量Ni2+胁迫下促进而高剂量胁迫下抑制的现象，但李艳梅等(2010)研究结果则表明，Cd2+胁迫导致棕尾别麻蝇幼虫血细胞包囊反应在48-72 h 内下降，96 h 后作用不明显。这可能是不同种类昆虫对不同重金属的胁迫表现出不同的免疫应答。我们在研究中还发现，斜纹夜蛾幼虫血细胞的凋亡在高剂量Ni2+的长期胁迫下也受到抑制(Sun et al.，2011)。因此，我们推测Ni2+胁迫对血细胞功能的影响可能是包囊反应受到影响的原因之一。

本文研究表明，5 mg/kg 及以下处理浓度Ni2+的1 代胁迫可提高0-120 h 幼虫血细胞对凝胶珠的包囊反应，但2-3 代的胁迫只增加发育初期0-72 h 幼虫血细胞的包囊反应;10-20 mg/kg 处理浓度Ni2+的1 代胁迫仅增加0-24 h 幼虫血细胞的包囊率，但可降低2-3 代幼虫血细胞各发育时间的包囊率;40 mg/kg Ni2+胁迫可降低连续3个世代各个发育阶段幼虫血细胞的包囊率;饲料中Ni2+剂量、胁迫世代数以及两者的交互作用均对幼虫血细胞的包囊率产生了显著影响。

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