SLE 患者血清对骨髓间充质干细胞衰老的作用及机制研究①

陈海凤 姚根宏 陈纬纬 李 霞 冯学兵 孙凌云

(南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科，南京 210008)

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus，SLE)是一类全身炎症性自身免疫病，循环中自身抗体及促炎因子的表达异常增高。而这些异常表达的细胞因子可引起免疫失调，导致组织器官损伤，阻断这些因子后，则可缓解狼疮病情。因此，SLE 患者体内炎症微环境对狼疮疾病的发生发展过程中起相当重要的作用。

细胞衰老是机体退化过程中生理功能下降和紊乱的表现，为不可逆的生命过程。细胞衰老可表现为细胞周期阻滞、生长调控蛋白(如p53、p21、p16等)异常表达、细胞形态改变、β-半乳糖苷酶活性增强等［1］。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是存在于骨髓中的一类干细胞，支持造血和调节免疫功能。而我们前期研究发现，SLE 患者骨髓MSC 在生长、凋亡、衰老、免疫调节、迁移、分化等多方面存在异常［2-4］。细胞状态正常与否直接影响其功能，而SLE 患者骨髓MSC 衰老增加且迁移及抗炎能力受损［3，5］。既往虽有研究报道老年人血清可影响干细胞功能，在细胞衰老过程中起重要作用［6，7］，但目前国内外尚未见SLE 患者血清对MSC衰老影响的研究报道。因此，本研究通过SLE 患者及健康对照者血清培养骨髓MSC，观察患者血清对细胞衰老的作用，明确SLE 骨髓MSC 异常衰老的主要原因。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 DMEM/F12、Penicillin/Streptomycin、胎牛血清(FBS)(Gibco 公司);兔来源p53 单克隆抗体、GAPDH 单克隆抗体(CST 公司);兔来源p21 单克隆抗体(Santa cruz 公司);兔来源p65、TBP单克隆抗体(CST 公司);细胞衰老检测试剂盒(Chemicon 公司);Trizol 试剂、Real time PCR 试剂盒(TaKaRa 公司)。

1.2 实验对象 南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科2011 年9 月至2012 年9 月6 例女性SLE住院患者，诊断符合美国风湿病学会1997 年修订的SLE 分类标准，均处于活动期，SLEDAI 评分≥8 分，收集非抗凝血20 ml，取上层血清，56℃30 min 补体灭活，-80℃保存备用;6 例健康对照者来源于年龄匹配的健康女性志愿者。骨髓亦来自于本院风湿免疫科收治的3 例SLE 患者及3 例骨科外伤手术患者，性别、年龄及体重匹配。所有实验均得到南京大学附属鼓楼医院医学伦理委员会的批准，血液采集前也获得患者和志愿者的知情同意。

1.3 骨髓间充质干细胞分离培养 于髂后上棘处穿刺取得骨髓液5～10 ml，用同体积PBS 稀释，将稀释后的骨髓液沿管壁缓慢加入到同体积的Ficoll人淋巴细胞分离液上，2 000 r/mim 离心20 min，轻轻吸出中间灰白色的淋巴细胞至另一离心管中，加入PBS 混匀，1 500 r/mim 离心5 min，弃上清，PBS重复洗涤一次，将分离的细胞用含10% FBS 的DMEM/F12 培养液接种于培养皿中，置37℃、5%CO2培养箱培养。24 h 后首次换液，去掉非贴壁细胞，以后每3 d 以L-DMEM 完全培养液换液。待细胞长到90%左右融合时，用0.25%胰蛋白酶EDTA混合液消化3～5 min，终止消化，离心后重新接种。在每次细胞传代时，采用台盼蓝染色计算细胞活力，要求大于95%，细胞冻存后复苏活力大于85%。流式细胞仪检测干细胞纯度:阳性指标CD73、CD90、CD105 表达率＞95%，阴性指标CD14、CD19、CD34、CD45、HLA-DR 表达率＜2%。

1.4 β-半乳糖苷酶染色 将MSC 5 ×104铺至六孔板，待细胞50%～60%融合，加入含有10%正常人或SLE 患者血清的DMEM/F12。培养3 d 后，弃去培养基，2 ml PBS 洗涤一次，加入1ml 固定液，室温孵育10～15 min，吸出固定液，2 ml PBS 洗涤2 次，加入2 ml 1 × SA-β-gal 测定液，37℃、无二氧化碳、避光条件下染色过夜。吸出染色液，2ml PBS 洗涤2次，光学显微镜下数蓝染细胞数，每次随机挑选8～10 个视野，计算阳性细胞比例。

1.5 Western blot MSC 置于含10%健康对照者或SLE 患者血清的DMEM/F12 中培养3 d，提取细胞总蛋白或核蛋白。用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，之后将蛋白转印到PVDF 膜上。用TBST［10 mmoL/L Tris-HCl (pH7.6)，150 mmol/L NaCl，0.05% Tween-20］洗3 次，之后用5%的脱脂奶粉封闭1 h，p53/p21/GAPDH 一抗杂交过夜，TBST 洗3次，再用辣根过氧化物酶标记的二抗杂交2 h，TBST洗3 次，最后用ECL 显影剂检测。

1.6 Real time PCR MSC 置于含10%健康对照者或SLE 患者血清的DMEM/F12 中培养2 d，提取RNA，根据TaKaRa 逆转录试剂盒说明逆转录成cDNA。以适量cDNA 为模板，在Taq 聚合酶催化下行real-time PCR 反应，PCR 循环条件设置:95℃，15 s→(95℃，5 s→60℃，30 s)×40 循环。电泳后采集的荧光数据分析用SDS2.1 软件进行。选择甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参照基因，p53ΔΔCT=SLE 血清处理组(CTp53 -CTGAPDH)-正常血清处理组(CTp53 -CTGAPDH);p21ΔΔCT=SLE 血清处理组(CTp21-CTGAPDH)-正常血清处理组(CTp21 -CTGAPDH)。引物序列如下:GAPDH 上 游5'-AGGCTAGCTGGCCC-GATTTC-3'，下 游 5'-TGGCAACAATATCCACTTT-ACCAGA-3';p53 上游5'-TCAGCATCTTATCCGAGT-GGAA-3'，下游5'-TGTAGTGGATGGTGGTACAGT-CA-3';p21 上游5'-GAAGACCATGTGGACCTGTCA-CT-3'，下游5'-GAAGATCAGCCGGCGTT-TG-3'。

1.7 CCK8 检测增殖 96 孔板加入细胞100 μl/孔(1 × 104)，以10% SLE 血清及健康对照血清的DMEM/F12 重悬，置37℃5% CO2细胞培养箱培养3 天;向各孔中加入10 μl 的新型细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK8)检测溶液;37℃孵育0.5、1.0、2.0 h(对照组OD 值控制在1.0 左右);酶标仪在450 nm 波长处检测每孔的光密度。

2 结果

2.1 SLE 患者血清增加骨髓MSC 的β-半乳糖苷酶阳性比例 与健康对照血清相比较，SLE 患者血清可增加正常人骨髓MSC(N MSC)β-半乳糖苷酶阳性细胞比例［(26.6±2.1)% vs (11.8±1.9)%，P＜0.05，图1］。SLE 血清培养SLE 患者骨髓MSC(SLE MSC)后，我们发现其β-半乳糖苷酶阳性比例［(58.8±2.8)%］较健康血清组［(31.2±2.2)%］更进一步显著增高(P ＜0.05，图1)。

图1 对照和SLE 患者血清对MSC 胞内SA-β-gal 的影响Fig.1 Effects of normal (N)and SLE serum on SA-β-gal in MSCs

图2 对照和SLE 患者血清对MSC 胞内p53 和p21 的影响Fig.2 Effects of normal (N)and SLE serum on expression of p53 and p21 in MSCs

2.2 SLE 患者血清上调骨髓MSC 胞内p53、p21 的表达 无论是N MSC，还是SLE MSC，SLE 患者血清处理后，可使细胞周期调控分子p53、p21 蛋白表达量显著增加(图2)。同时p53、p21 的基因检测结果也显示SLE 患者血清亦可明显升高其基因表达水平(P ＜0.05，图2)。

2.3 SLE 血清抑制骨髓MSC 增殖 SLE MSC 的细胞增殖能力较N MSC 明显减弱。本研究发现SLE血清不仅可显著降低N MSC 的增殖能力［(0.7±0.1)vs (1.1±0.1)，P ＜0.01］，还能够进一步抑制SLE MSC 的增殖能力［(0.5±0.2)vs (0.8±0.3)，P ＜0.05］，如图3 所示。

2.4 SLE 血清促进骨髓MSC 胞内NF-κB 通路活化N MSC、SLE MSC 分别以10%健康血清及SLE 患者血清处理3 天，提取细胞核蛋白。如图4 所示，无论N MSC，或是SLE MSC，SLE 血清均显著增加NFκB(p65)蛋白量，提示SLE 血清处理可激活MSC 胞内NF-κB 信号通路。

图3 对照和SLE 患者血清对MSC 增殖的影响Fig.3 Effects of normal (N)and SLE serum on proliferation of MSCs

图4 对照和SLE 血清处理MSC 核内NF-κB(p65)表达情况Fig.4 NF-κB (p65)expression in nuclei of MSCs treated with normal (N)and SLE serum

3 讨论

细胞衰老缺乏特异性检测指标，需要两种或两种以上指标联合评估衰老。因此，我们采用β-半乳糖苷酶以及细胞周期调控分子p53/p21 三种指标联合检测细胞衰老。本研究首次证实SLE 患者循环血清可导致正常和患者来源骨髓MSC 衰老增加，且在此过程中与衰老相关的NF-κB 通路明显活化。

我们课题组曾报道SLE 患者骨髓MSC 在增殖、衰老及免疫调节等方面存在多种异常，但是其具体机制尚不清楚。我们既往研究证实年轻未发病的狼疮骨髓MSC 功能正常，类似于正常鼠骨髓MSC［8］，说明遗传并非介导MSC 异常的主要因素。因此，我们推测SLE MSC 异常可能是机体全身炎性环境所致。而近年来，越来越多的研究证实了机体全身环境对成体干细胞衰老及功能的重要性。例如，年轻的机体环境可使得衰老的祖细胞“返老还童”［9，10］。此外，老年鼠的血清可导致MSC 衰老增加［11］。上述多项研究结果均支持我们的观点，即“机体全身血液微循环对细胞状态及功能相当重要”。因此，我们研究了SLE 患者炎性血清微环境对MSC 衰老的影响及其可能机制。

本研究采用含10% SLE 血清及健康血清的培养基分别模拟炎症及健康的全身微环境，结果与健康对照相比，SLE 患者血清可明显促进健康者及SLE 患者骨髓MSC 衰老，同时还抑制MSC 增殖。上述结果提示SLE 患者炎症性全身微环境可导致骨髓MSC 过度衰老;而衰老MSC 的迁移能力下降，抗炎调节能力减弱［5］，故SLE 患者血清诱导MSC 衰老，进而影响其功能，这可能进一步加重SLE 患者病情的进展。

曾有研究证实随着年龄增长，NF-κB 活性显著增加，且DNA 损伤亦可激活NF-κB 信号［12］。此外，NFκB 抑制剂可减轻DNA 损伤和应激反应，最终延缓衰老［13］，这提示NF-κB 信号参与衰老进程。本研究提取MSC 核蛋白并检测活性NF-κB(p65)，观察到SLE患者血清诱导骨髓MSC 衰老的同时，NF-κB 信号通路亦显著激活，表明在此衰老过程中NF-κB 信号可能起到重要作用。而该通路是否为决定该细胞衰老过程的唯一信号通路仍有待我们进一步研究。

有研究表明促炎因子IFN-α、IFN-β、IFN-γ 等可诱导内皮细胞及胆管上皮细胞DNA 损伤，促进细胞衰老［14-17］。而SLE 是公认的全身炎症性自身免疫病，伴随循环中多种促炎因子(IFN-α、IFN-γ、leptin)升高，这些异常升高的细胞因子可直接或间接激活免疫细胞从而加重病情。这些证据进一步证明了骨髓MSC 衰老可由SLE 全身循环血清诱导所致，但需要明确SLE 患者血清究竟哪些因子起最为关键的作用，才能为靶向改善细胞状态及功能，缓解狼疮疾病提供依据。

总之，本研究初步阐明了SLE 患者骨髓MSC 异常衰老的主要原因，这有助于指导我们改善机体炎症环境，从而恢复MSC 功能，增强其免疫调节能力，进而缓解狼疮病情，为临床治疗SLE 提供新的思路和方法。

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