3-MA 对三氧化二砷诱导Jurkat 细胞凋亡作用的影响①

王艳婕 牛志国 郭继强 王 辉 牛新清 (新乡医学院免疫学研究中心，新乡 453003)

自噬对肿瘤细胞具有双重作用，是继坏死和凋亡后发现的第3 种细胞死亡形式。自噬通过清除肿瘤细胞内折叠异常的蛋白和功能异常的细胞器来抑制肿瘤的发生，同时肿瘤细胞可利用自噬作用使自身在营养缺乏和低氧的状况下得以存活［1，2］。在多种肿瘤放化疗的过程中，可以观察到肿瘤细胞的自噬水平明显升高［3］。这一现象提示，自噬可能是肿瘤细胞放化疗耐受的一种机制，抑制肿瘤细胞的自噬可能会增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性［4］。因此，自噬抑制剂与常规治疗的联合应用可能是提高疗效的潜在手段。三氧化二砷(As2O3)是临床上常用的抗肿瘤药，通过诱导肿瘤细胞的分化和凋亡有效治疗多种恶性肿瘤。本研究探讨了自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)对As2O3诱导的Jurkat 细胞凋亡的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 急性T 细胞白血病细胞系Jurkat细胞株由新乡医学院免疫中心实验室王辉教授惠赠。XTT 及硫酸酚嗪甲脂(PMS)均为Sigma 公司产品，三氧化二砷(As2O3)为哈尔滨伊达药业有限公司产品，3-MA 为Sigma 公司产品，AnnexinV-FITC 凋亡检测试剂盒购自嘉美生物，RPMI1640 为Gibco 公司产品，胎牛血清杭州购自四季青生物公司。ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;兔抗人微管相关蛋白1 轻链3B (microtubule associated protein 1 light chain 3B，LC-3B)抗体购自Sigma;β-actin单克隆抗体(mAb)、HRP 标记的山羊抗兔二抗、HRP 标记的山羊抗小鼠二抗、FITC 标记的山羊抗兔二抗购自Proteintech。

1.2 实验方法

1.2.1 XTT 检测不同浓度As2O3对Jurkat 细胞生长抑制作用 取对数生长期Jurkat 细胞，调整细胞浓度10 ×104ml-1，均以80 μl/孔种植于96 孔细胞培养板，加入不同终浓度(2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L)的As2O3处理细胞24 h 后检测细胞生长指数，选择最佳浓度分别于0、24、48 h 检测细胞生长抑制作用。每个药物浓度设置三个复孔，以不加药物孔的细胞培养液作为空白对照，37℃、5%CO2培养箱中孵育后加入终浓度为0.2 mg/ml 的XTT 及终浓度为25 μmol/ml 的PMS 混合液20 μl/孔，于培养箱中避光孵育2 h 后，在酶标仪上450 nm，630 nm双波长测定OD 值，A 值3 孔取均值。计算不同药物浓度下的细胞生长指数和生长抑制率。细胞生长指数(%)=实验组OD 值/对照组OD 值。抑制率=［(OD 对照组-OD 加药组)/OD 对照组］×100%。

1.2.2 透射电镜观察各组细胞自噬变化 取对数生长期细胞，用RPMI 培养液调整细胞浓度为1 ×106ml-1，接种于6 孔板，每孔加入细胞悬液2 ml，培养箱中继续培养2 h 后加药。第一孔为对照不加药组，后三孔加药组使As2O3终浓度为2.5、5、10 μmol/L，每组设3 个复孔，培养箱中培养24 h 后收集细胞，离心后2.5%戊二醛固定液固定细胞。

1.2.3 免疫印迹 24 孔板每孔加入含有1 ×106个Jurkat 细胞的1 ml 细胞悬液，对照组加入PBS，实验组加入终浓度为5 μmol/L As2O3，单独或联合加入10 mmol/L 的3-MA;培养24 h 和48 h 后提蛋白，免疫印迹检测β-actin 蛋白及LC-3B 蛋白表达。一抗1∶1 000 稀释，4℃过夜，二抗1∶1 000 稀释，室温孵育1.5 h，ECL 发光。

1.2.4 流式细胞术检测Jurkat 细胞LC-3B 的表达24 孔板每孔加入含有1 ×106个Jurkat 细胞的1 ml细胞悬液，加入终浓度为5 μmol/L As2O3，培养24 h和48 h 后，收集细胞;2 ml/L Triton-X100 室温15 min，加入10 μl LC-3B mAb 或正常鼠血清(同型对照)室温孵育30 min;PBS 洗涤2 次后加入FITC 标记的二抗，室温孵育30 min，PBS 洗涤2 次，300 目过滤后上机检测。以实验组平均荧光强度(mean fluorescence intensity，MFI)除以同一批同型对照的均数表示LC-3B 的表达水平。

1.2.5 流式细胞仪检测Jurkat 细胞凋亡 取对数生长期细胞，用RPMI 培养液调整细胞浓度为1 ×106ml-1，接种于6 孔板，每孔加入细胞悬液2 ml，培养箱中继续培养。24 h 后加药，第一孔为对照组，后两孔使药物终浓度为As2O35 μmol/L，As2O35 μmol/L 联合3-MA 10 mmol/L，每组设3 个复孔，放入培养箱中继续培养。药物作用24 h 后收集细胞，将细胞悬于300 μl Binding Buffer;先后加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl 的碘化丙啶(PI)，轻轻混匀，避光，室温反应15 min，流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0 软件进行统计学分析。数据以±s 表示，组间分析进行t 检验，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 As2O3对Jurkat 细胞增殖的影响 As2O3处理Jurkat 细胞24 h 后，2.5、5、10、20、40 μmol/L 的细胞生长指数分别为(97.33±0.32)%、(80.57±1.05)%、(74.70±0.50)%、(70.40±0.17)%、(71.20±0.49)%，As2O3浓度自5.0 μmol/L 开始有明显作用，随着浓度增加抑制率增强(P ＜0.01，图1)。不同浓度As2O3分别处理细胞24 h 后，电镜结果显示，正常对照组细胞膜完整，细胞核染色质均匀。2.5 μmol/L As2O3作用Jurkat 细胞后，电镜下可见少量双层膜结构的自噬体;5.0 μmol/L As2O3作用Jurkat 细胞后，出现细胞体积缩小、胞浆浓缩、胞核体积减小，可见核染色质聚集或沿核膜收缩边集，部分染色质致密成斑块状，此种超微结构明显区别于正常及死亡细胞，为典型的初期凋亡形态。同时胞质内仍可见较多的自噬体和其特征性独立双层膜结构;10 μmol/L As2O3作用Jurkat 细胞后，可见细胞器肿胀，细胞核稀疏成网状，细胞膜破裂，细胞肿胀等坏死形态特征的出现，同时胞质内出现了更多的自噬体，见图2。考虑临床用药有效性及安全性，选用As2O3最佳浓度5 μmol/L 分别处理Jurkat 细胞0、24、48 h 后，Jurkat 细胞的生长抑制率分别为(1.4±1.2)%、(21.7±5.3)%、(58.9±9.4)%，24 h 和48 h 均明显表现为明显的细胞毒作用，且随着时间的增加逐渐增强(P ＜0.05，图3)。

图1 As2O3对Jurkat 细胞增殖的影响Fig.1 As2O3inhibit proliferation of Jurkat cells

图2 As2O3对Jurkat 细胞超微结构的影响Fig.2 Ultrastructure of As2O3on Jurkat cells

图3 As2O3对Jurkat 细胞的生长抑制率Fig.3 Growth inhibition rate of As2O3on Jurkat cells

图4 免疫印迹检测As2O3处理后LC-3B 蛋白的表达Fig.4 LC-3B protein expression of As2O3on Jurkat cells by western blot

图5 流式细胞技术检测As2O3处理后LC-3B 的表达Fig.5 LC-3B protein expression of As2O3on Jurkat cells by flow cytometry

2.2 As2O3处理后LC3 蛋白的表达 5 μmol/L 的As2O3处理Jurkat 细胞后，0 h 并未检测到LC-3B 蛋白的表达，24 h 和48 h 的LC-3B 表达水平随时间增加而显著性升高(图4)，与电镜结果吻合;流式细胞技术检测显示As2O3处理细胞后，0、24、48 h 的MFI相对倍数为(3.1±0.2)、(4.6±0.31)、(34.2±4.5)倍(图5)，各组之间两两对比均有显著性差异(P ＜0.01，图6)，与免疫印迹结果吻合。

图6 LC-3B 的平均荧光强度MFIFig.6 Mean fluorescent intensity of LC-3B protein

图7 各处理组Jurkat 细胞的抑制率Fig.7 Inhibition rate of Jurkat cells each group

图8 免疫印迹检测各组LC-3B 蛋白的表达Fig.8 LC-3B protein expression of each group by Western blot

图9 各处理组Jurkat 细胞的凋亡率Fig.9 Apoptosis rate of Jurkat cells each group

2.3 3-MA 对As2O3诱导自噬的抑制作用 PBS、10 mmol/L 的3-MA、5 μmol/L 的As2O3及3-MA 联合As2O3处理细胞48 h 后，其生长抑制率分别为(1.2±1.4)%、(9.7±3.3)%、(33.4±9.1)%、(60.6±8.3)%，3-MA 联合As2O3处理Jurkat 细胞48 h 后，相对As2O3，生长抑制率明显上升(P ＜0.01，图7)，同时免疫印迹检测显示，相对于As2O3组，3-MA 联合As2O3处理细胞48 h 后，LC-3B 的表达减弱(图8)。

2.4 3-MA 对As2O3诱导Jurkat 细胞凋亡的作用 5 μmol/L As2O3，5 μmol/L AS2O3联合10 mmol/L 3-MA 作用Jurkat 细胞48 h，凋亡细胞百分数分别为(2.94±0.26)%，(44.96±3.60)%，与单用As2O3处理组相比，联用自噬特异性抑制剂3-MA 组的凋亡细胞百分数明显升高(P ＜0.05)，见图9。

3 讨论

细胞凋亡、细胞自噬和坏死在肿瘤发生、发展和治疗中有着重要的意义。越来越多的研究发现，自噬和凋亡作为细胞程序性死亡的两种方式，在某些情况下相互促进或拮抗，可先后发生或同时存在于同一细胞，可能共同决定恶性肿瘤的命运［5，6］。这种混合多种形式的细胞死亡使我们看到细胞死亡方式之间存在相互关系，特别是凋亡和坏死［7］。As2O3诱导急性T 淋巴细胞白血病细胞凋亡涉及了复杂的多信号通路，机理尚不清楚。临床上化疗药尽管有不同的靶位和机理，但均引起肿瘤细胞的凋亡。肿瘤细胞通常对诱导凋亡较敏感，但最终产生凋亡耐受［8］。近年来，人们研究发现自噬参与了化疗耐药并且与化疗及放疗的敏感性有关，研究也证实了这一点［9］。

研究表明，临床上治疗急性早幼粒细胞白血病时，As2O3的血浆浓度峰值为6～7 μmol/L，然后下降并维持在1～2 μmol/L［10］。本实验观察到As2O3可以抑制急性T 淋巴细胞白血病细胞株Jurkat 细胞的生长，这种作用呈剂量和时间依赖性，与As2O3敏感细胞株K562 细胞相比，Jurkat 细胞对As2O3敏感性略低。5 μmol/L As2O3作用Jurkat 细胞24、48 h后生长抑制率与自噬公认标志物LC-3B 表达水平均随时间呈依赖性升高，联用3-MA 后比单用As2O3组LC-3B 表达降低，表明As2O3化疗诱发的Jurkat细胞中自噬呈现高表达。由于自噬的本质是细胞通过吞噬不必要的细胞器以保证细胞度过外界的应激，这提示在急性T 淋巴细胞白血病细胞化疗中存在的细胞自噬可能是化疗抵抗的一个原因。

5 μmol/L As2O3作用Jurkat 细胞24 h 后发生了细胞凋亡并可见较多的自噬体，10 μmol/L As2O3作用Jurkat 细胞24 h 后出现了细胞坏死和更多的自噬体。此外，我们的实验还表明，在临床有效血药浓度时，As2O3诱导急性T 淋巴细胞白血病细胞株Jurkat 细胞的凋亡不明显，但是当联用自噬抑制剂3-MA 后，凋亡细胞明显增多，说明抑制自噬增强了AS2O3诱导的凋亡作用，证明了As2O3联合自噬抑制剂在治疗急性T 淋巴细胞白血病中的应用价值。

随着对自噬、凋亡与血液系统肿瘤关系的深入研究，相信靶向性药物及自噬基因的靶向治疗将为肿瘤治疗带来更好的前景。

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