靶向干扰前列腺源性ETS 因子促进HT29 细胞的增殖与侵袭

张毅强 师帅帅 郭改娥 裴晋红 汪军梅 苏 娇 (长治医学院生物化学教研室，长治 046000)

前列腺源性转录因子(Prostate-derived Ets factor，PDEF)是Libermann［1］在前列腺特异性抗原基因中发现的ETS(E-twenty-six transformation specific)家族转录因子［2］。ETS 因子正常存在于细胞的一些生理和病理过程中［3-6］，控制着靶基因的表达，而这些靶基因调控着细胞的增殖、分化、凋亡。因此ETS 因子是十分重要的转录因子。已有研究表明在某些肿瘤的发生过程中伴随着多种ETS 因子的表达失调［7，8］，因此ETS 因子可能在肿瘤的产生过程中起到了关键性的作用［9-11］。PDEF 作为ETS 家族转录因子的一员，其在肿瘤中的作用近年来受到了重视，尤其是发现在结直肠组织中其表达可以促进分泌性祖细胞向杯状细胞分化，因此推断结直肠癌的发生可能与PDEF 的表达有关［12］。本文在前期研究的基础上，构建干扰质粒，干扰在HT29 细胞中高表达的PDEF 基因，观察对HT29 细胞株的生物学行为的影响，为进一步研究结直肠癌的发病机制及靶向治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 E.coli DH5α 克隆菌株及结直肠癌HT29细胞株(PDEF 高表达，为非侵袭性结直肠腺癌细胞株)为我室留存，DMEM 高糖培养基购自Gibco 公司。PDEF 真核shRNA 干扰质粒GV102(sense5'-GGCCGCUUCAUUAGGUGGCUTT-3'，antisense5'-AGCCACCUAAUGAAGCGGCCTT-3')，购自上海吉凯基因有限公司。质粒小量提取试剂盒购自Omega 公司，LipofectamineTM2000 转染试剂及TRIzol 购于美国Invitrogen 公司。四甲基偶氮唑蓝［3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)2、5-diphenyltetra-zolium，MTT］、Boyden chamber含8 μm 滤膜购自索莱宝公司，matrigel 购自美国BD公司。鼠抗人PDEF 单克隆抗体购自Abcam 公司，鼠抗人β-actin 多克隆抗体及HRP 标记的山羊抗小鼠IgG 购自Santa Cruz 公司。ECL 低背景化学发光试剂盒购自康为世纪公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 结直肠癌细胞HT29 常规培养于含10%胎牛血清、100 U/ml 的青霉素、100 mg/L 链霉素的DMEM 高糖培养基中，置37℃、5%CO2培养箱内培养。

1.2.2 shRNA 瞬时转染HT29 细胞株 实验分组分别为正常对照组(细胞未经任何处理)、空白对照组(仅转染空质粒)和shRNA 组(转染特异干扰shRNA)。收集对数生长期细胞接种于6 孔培养板中，待细胞长至70%融合时，将5 μl Lipofectamine 2000 与10 μl GV102 或空白对照质粒(空质粒)分别稀释于终体积为500 μl 无血清无抗生素的DMEM 高糖培养基中，室温避光放置20 min，用无血清无抗生素DMEM 高糖培养基冲洗细胞3 次后，缓慢加入已稀释好的脂质体与质粒DNA 混合液，补充无血清培养基至2 ml，使混合液均匀分布于培养基中。培养6 h 后补加胎牛血清至终浓度为20%，18 h 后换完全培养基继续培养。24 h 后观察转染结果。

1.2.3 RT-PCR 检测干扰前后PDEF 基因mRNA 的表达 细胞对数生长期取出6 孔板中的转染HT29 细胞，DEPC 水洗3 次后每孔加入1 ml TRIzol，吹打细胞，移入1.5 ml EP 管中，按照TRIzol 说明进行细胞总RNA 提取。取1 μl 抽提的RNA 用DEPC 水稀释50 倍后，以DEPC 水做空白对照，测定RNA 浓度。反转录过程按TaKaRa 试剂说明书进行操作。引物序列为:PDEF 上游引物:5'-TTACAAGAAGGGCATCATCC-3'，下游引物:5'-GAAGGTCAGAGCAGCAGAGC-3'，扩增产物为188 bp，GAPDH 上游引物:5'-TCCTCTGACTTCAACAGCGACA-3'，下游引物:5'-TTCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3'扩增产物为202 bp。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 循环条件为:95℃预变性10 min;95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，30 个循环;72℃延伸10 min。结果进行统计学分析。

1.2.4 Western blot 检测干扰前后PDEF 蛋白的表达 提取细胞总蛋白，吸弃培养液，用1 ×PBS 洗涤3次。加入RIPA 裂解液，冰上裂解5 min。用细胞刮子将细胞碎片和裂解液移至EP 管中，4℃、12 000 r/min，离心20 min，其上清为提取的蛋白。将上清液小心转移至新EP 管中，考马斯亮蓝法测定蛋白浓度定量后分别加入5 ×SDS-PAGE 上样缓冲液，沸水煮5 min。上样进行聚丙烯凝胶电泳，半干电转将蛋白条带转移到PVDF 膜(0.22 μm)上，用含5%脱脂奶粉的封闭液封闭1.5 h，一抗(小鼠抗人PDEF，稀释度1∶1 000)4℃孵育过夜，HRP 标记的兔抗鼠IgG 的二抗(1∶1 000)二抗孵育2 h，用TBST 洗膜后，ECL 化学发光试剂显色，β-actin 作为内参，图像分析系统测定灰度值。

1.2.5 MTT 法检测细胞的增殖情况 胰酶消化对数生长期细胞，用含10%胎牛血清的DMEM 培养基吹打成单细胞悬液，以每孔104个细胞接种于96 孔培养板上，每孔体积100 μl，置于37℃、5%CO2培养箱培养，每组6 孔，分别在第1、2、3、4、5天以MTT 法检测其吸光度(A)值。每孔中加入20 μl MTT(5 mg/ml)液继续培养4 h，吸去上清液，加入150 μl/孔DMSO，震荡10 min，使结晶充分溶解。用酶标仪在490 nm 波长比色测定每孔A 值，绘制生长曲线。

1.2.6 Transwell 侵袭实验 将50 μl，1∶3稀释的Matrigel 胶均匀平铺于24 孔Transwell 小室8 μm 的PC 膜上，避免产生气泡，将板置37℃培养箱30 min聚合成凝胶备用。用无血清的DMEM 培养液调整细胞浓度为1 ×105ml-1，上室分别加入200 μl 的细胞悬液，24 孔板下室加入每孔500 μl 含10%胎牛血清的DMEM 培养液，每组各3 孔，随后将装有Transwell 小室的培养板置入培养箱中培养24 h，吸弃上室液体、取出小室，以湿棉签擦去聚碳酸酯微膜上的胶，进行苏木精和结晶紫染色，冲洗后封片，于倒置显微镜下观察穿过膜的细胞数目。

1.3 统计学分析 应用SPSS13.0 软件进行统计分析，数据以±s 表示，服从正态分布的数据，用多组间比较，符合方差齐性的，用方差分析。P ＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 shRNA 干扰质粒在HT29 细胞中的表达 通过LipofectamineTM2000 转染试剂将干扰质粒转染HT29细胞。由于shRNA 组GV102 带有EGFP 标记，转染成功后可见绿色荧光蛋白表达。图1B 为转染36 h后，荧光显微镜下观察的结果，可见绿色荧光蛋白的表达，说明干扰质粒成功转染入HT29 细胞株，图1A为未转染质粒组，无绿色荧光蛋白表达。

2.2 实时定量PCR 检测PDEF 基因mRNA 表达的抑制情况 将上述3 组细胞培养48 h 后分别提取总RNA，逆转录为cDNA，表达情况用荧光实时定量PCR 技术检测，以GAPDH 作为内参，每组重复3 次。经2-△△CT分析与空白对照组相比，空白对照组为2-△△CT值 为0.99±0.09，shRNA 组 为0.67±0.07。shRNA 组与正常对照组相比，PDEF 基因mRNA 表达水平降低34%，有统计学意义(P ＜0.05)，而正常对照组和空白对照组相比无统计学差异(P ＞0.05)，可以说明转染干扰质粒的细胞中PDEF 基因mRNA 的表达受到抑制(图2)。

图1 荧光显微镜观察HT29 细胞转染效果图(×100)Fig.1 Transfer efficiency into HT29 cells under fluorescent microscope(×100)

图2 实时荧光定量PCR 检测PDEF 基因mRNA 相对表达统计分析图Fig.2 Statistical analysis diagram real-time fluorescent quantitative PCR detection PDEF gene mRNA relative expression

2.3 Western blot 检 测PDEF 蛋白表达情况 Western blot 显示正常对照组、空白对照组及shRNA 组各组灰度比值分别为:0.86±0.03，0.85±0.03，0.52±0.01(图3B)。shRNA 组与正常对照组相比，PDEF 蛋白表达降低(图3A)，灰度分析显示，shRNA 组与正常对照组相比，细胞中PDEF 蛋白水平下调(图3A)，有统计学意义(P ＜0.05)。空白对照组和正常对照组相比无统计学差异(图3A)(P ＞0.05)。

图3 Western blot 分析PDEF 蛋白的表达Fig.3 Western blot analysis PDEF protein expression

图4 shRNA-PDEF 对HT29 细胞增殖的影响Fig.4 Effects of shRNA-PDEF on HT29 cell proliferation

2.4 干扰质粒对HT29 细胞增殖的影响 分别于细胞生长的第1、2、3、4、5 天，加入MTT，继续培养生成蓝色的formazan 结晶，加入DMSO 溶解formazan 结晶，酶标仪测定490nm处的光密度OD值，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比。OD 值越高反应细胞增殖能力越强。本实验中shRNA 组OD值在细胞生长的第3 天开始与空白对照组相比，OD值明显增高，表明细胞的增殖能力明显增强，差异有统计学意义(P ＜0.05)，而正常对照组与空白对照组OD 值无明显差别(P ＞0.05)，结果表明PDEF 基因沉默能促进肿瘤细胞的增殖(图4)。

2.5 Transwell 侵袭实验结果 HT29 细胞转染干扰质粒后48 h，Transwell 侵袭实验结果显示，正常对照组、空白对照组、shRNA 组，各组穿膜细胞数分别为:28.66±2.08、31±6.24、77.33±7.76(图5)。穿过Matrigel 胶的干扰组细胞数目(图6)显著高于正常对照组的细胞(图6)，shRNA 组平均每高倍视野侵出Matrigel 胶的细胞数与正常对照组相比显著增加，差异有统计学意义(P ＜0.05)，空白对照组平均每高倍视野侵出Matrigel 胶的细胞数(图6)与正常对照组(图6)相比无显著差异(P ＞0.05)，结果表明干扰PDEF 基因表达后，HT29 细胞的侵袭能力增强。

图5 各组HT29 穿膜细胞数Fig.5 Numbers of invasion HT29 cells in each group

图6 HT29 细胞Transwell 侵袭实验光镜照片(×200)Fig.6 HT29 cell Transwell experiment using photos (×200)

3 讨论

结直肠癌是常见的消化道肿瘤之一，其发病率呈逐年上升的趋势［13］。对于该疾病的治疗已经有了很大的进展，但治疗方法特异性低，导致了治疗效果欠佳。因此研究对于该疾病的较特异的治疗方案是提高大肠癌患者生存率的关键。因而，寻找结直肠癌特异的治疗方法具有重要的意义。

PDEF 是个新发现的EST 家族的转录因子，相对分子质量为37 500 Da［14］，定位于6 号染色体短臂上(6P21.3)，PDEF 中存在许多磷酸化位点，可能参与多条信号转导通路，已有研究报道，在一些肿瘤的形成过程中［15-17］，伴随着PDEF 的表达失调，这表明PDEF 因子具有较强的肿瘤相关性特点［18-21］。本研究在该课题前期研究的基础上，进一步干扰PDEF 基因的表达可能为结肠癌的治疗提供新的思路。

本文通过shRNA 技术沉默人结直肠癌细胞株HT29 中PDEF 基因的表达，观察该基因沉默后HT29 细胞生物学行为如细胞增殖和侵袭的改变。RT-PCR、Western blot 结果表明干扰PDEF 基因后HT29 细胞中PDEF 基因mRNA 及蛋白的表达水平与正常对照组和空白对照组相比均降低，差异有统计学意义(P ＜0.05)。细胞生长曲线分析表明，shRNA 组与正常对照组、空白对照组相比细胞增殖能力加强(P ＜0.05)。

本实验在体外证明了PDEF 在结直肠癌细胞中发挥了潜在的抑癌作用，抑制其表达促进了HT29细胞的增殖与侵袭能力。虽然本研究体外实验结果支持PDEF 在结直肠癌中的抑癌作用，但其具体的发病机制还有待研究，进一步的组织学水平和体内实验有待开展。PDEF 作为转录因子，很可能是影响了某种靶基因的表达，而该靶基因必定在细胞的增殖分化等生理过程中发挥着重要的作用，因此寻找PDEF 作用的靶基因也是下一步研究工作的重点，这有望为结直肠癌的治疗提供新的靶点，将有可能为结直肠癌的靶向治疗提供新的途径。

［1］Oettgen P，Finger E，Sun Z，et al.PDEF，a novel prostate epithelium-specific ets transcription factor，interacts with the androgen receptor and activates prostate-specific antigen gene expression［J］.J Biol Chem，2000，275(2):1216-1225.

［2］Deves C，Renck D，Garicochea B，et al.Analysis of select members of the E26 (ETS)transcription factors family in colorectal cancer［J］.Virchows Arch，2011，458(4):421-430.

［3］Noah TK，Kazanjian A，Whitsett J，et al.SAM pointed domain ETS factor (SPDEF)regulates terminal differentiation and maturation of intestinal goblet cells［J］.Exp Cell Res，2010，316 (3):452-465.

［4］Meadows SM，Myers CT，Krieg PA.Regulation of endothelial cell development by ETS transcription factors［J］.Semin Cell Dev Biol，2011，22(9):976-984.

［5］Buchwalter G，Hickey MM，Cromer A，et al.PDEF promotes luminal differentiation and acts as a survival factor for ER-positive breast cancer cells［J］.Cancer Cell，2013，23(6):753-767.

［6］Schaefer JS，Sabherwal Y，Shi HY，et al.Transcriptional regulation of p21/CIP1 cell cycle inhibitor by PDEF controls cell proliferation and mammary tumor progression［J］.J Biol Chem，2010，285(15):11258-11269.

［7］Sood AK，Kim H，Geradts J.PDEF in prostate cancer［J］.Prostate，2012，72(6):592-596.

［8］Sood AK.PDEF and PDEF-induced proteins as candidate tumor antigens for T cell and antibody-mediated immunotherapy of breast cancer［J］.Immunol Res，2010，46(1-3):206-215.

［9］Pal M，Koul S，Koul HK.The transcription factor sterile alpha motif(SAM)pointed domain-containing ETS transcription factor (SPDEF)is required for E-cadherin expression in prostate cancer cells［J］.J Biol Chem，2013，288(17):12222-12231.

［10］Steffan JJ，Koul HK.Prostate derived ETS factor (PDEF):a putative tumor metastasis suppressor［J］.Cancer Lett，2011，310(1):109-117.

［11］顾婷婷，谷圣美，金 伟，等.ETS2 在乳腺癌细胞中调控CXCR4 转录的机制研究［J］.中国癌症杂志，2013，23(11):892-899.

［12］Gregorieff A，Stange DE，Kujala P，et al.The ets-domain transcription factor SPDEF promotes maturation of goblet and paneth cells in the intestinal epithelium［J］.Gastroenterology，2009，137(4):1333-1345.

［13］Zavoral M，Suchanek S，Majek O，et al.Colorectal cancer screening:20 years of development and recent progress［J］.World J Gastroenterol，2014，20(14):3825-3834.

［14］Wasylyk B，Hagman J，Gutierrez-Hartmann A.Ets transcription factors:nuclear effectors of the Ras-MAP-kinase signaling pathway［J］.Trends Biochem Sci，1998，23(6):213-216.

［15］Ghadersohi A，Odunsi K，Zhang S，et al.Prostate-derived Ets transcription factor as a favorable prognostic marker in ovarian cancer patients［J］.Int J Cancer，2008，123(6):1376-1384.

［16］Mukhopadhyay A，Khoury T，Stein L，et al.Prostate derived Ets transcription factor and Carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 6 constitute a highly active oncogenic axis in breast cancer［J］.Oncotarget，2013，4(4):610-621.

［17］Johnson TR，Koul S，Kumar B，et al.Loss of PDEF，a prostate-derived Ets factor is associated with aggressive phenotype of prostate cancer:regulation of MMP 9 by PDEF［J］.Mol Cancer，2010，9:148.

［18］Turner DP，Findlay VJ，Kirven AD，et al.Global gene expression analysis identifies PDEF transcriptional networks regulating cell migration during cancer progression［J］.Mol Biol Cell，2008，19(9):3745-3757.

［19］Sabherwal Y，Mahajan N，Helseth DL，et al.PDEF downregulates stathmin expression in prostate cancer［J］.Int J Oncol，2012，40(6):1889-1899.

［20］Turner DP，Findlay VJ，Moussa O，et al.Mechanisms and functional consequences of PDEF protein expression loss during prostate cancer progression［J］.Prostate，2011，71(16):1723-1735.

［21］Feldman RJ，Sementchenko VI，Gayed M，et al.Pdef expression in human breast cancer is correlated with invasive potential and altered gene expression［J］.Cancer Res，2003，63 (15):4626-4631.