姜黄素对佐剂性关节炎大鼠滑膜OPG 和RANKL 蛋白表达的影响①

邱 艳 商 玮 赵智明 郭郡浩 蔡 辉 赵凌杰

(南京军区南京总医院 中西医结合科，南京 210002)

类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以全身性多关节的滑膜炎为特征的自身免疫性疾病，它最终会渐进性导致关节软骨和骨破坏。滑膜炎症和骨破坏是两个紧密相连的过程，它们是RA患者致残的主要原因，其致残率为80%［1］。RA 骨破坏的病理生理机制并未被完全阐明，骨保护素(Osteoprotegerin，OPG)和核因子κB 受体活化因子配体(Receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL)系统被认为参与到RA 的骨重建和骨吸收过程。RA 的治疗主要有非甾体抗炎药、慢作用抗风湿药、糖皮质激素、生物制剂(TNF-α 阻断剂、IL-6抑制剂、JAK 激酶抑制剂)等。这些药物副作用较多，包括胃肠道出血、骨髓抑制、加速骨质疏松症、高血压、肝毒性、眼毒性、过敏性反应，且价格昂贵以及增加感染及肿瘤的风险。姜黄素(Curcumin，CUR)是从姜科植物姜黄、郁金等根茎中萃取有效单体，化学结构为C21H2006，具有广泛的生物学活性，能够通过调节多个转录因子及信号通路发生作用。现代药理学认为姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等多方面药理作用［2］。本文通过观察姜黄素对佐剂性关节炎大鼠滑膜病理及OPG、RANKL 蛋白表达的影响，进一步探讨其对RA 的作用机制，为姜黄素治疗RA 提供动物实验参考。

1 材料与试剂

1.1 动物 雄性SD 大鼠30 只，清洁级，实验起始体质量140～160 g，由南京军区南京总医院的实验动物中心供应，使用许可证:SYXK20030032(苏)。

1.2 药品、试剂与仪器 CUR 溶液:浓度为5 mg/ml(将CUR 500 mg 溶解于无菌的DMSO 10 ml，再加无菌生理盐水直至100 ml，用5 ml 注射器进行分装，保存需要避光，冰箱温度调节在-20℃，1 周内使用完，禁止反复冻融)。PBS 缓冲液:(将NaCl 8.00 g、KCl 0.20 g、Na2HPO4·12H2O 3.63 g、KH2PO40.24 g 溶解于900 ml 的双蒸水，并将pH 值调节至7.2～7.4，定容至1 000 ml，高压灭菌，室温保存)。

1.3 方法

1.3.1 分组及造模方法 将大鼠以随机数字表法分为3 组:正常组、模型组、姜黄素组，每组10 只。用标准饲料饲养，饮水自由，将室温控制在18℃～26℃之间，湿度调控在70%左右，适应性喂养1 周。参照文献［3］方法，具体操作如下:除了正常组不造模，将其余2 组大鼠左后跖处进行常规消毒，皮内注射FCA(美国Sigma 公司)0.1 ml，制成AA 模型，造模当天记做第0 天(d 0)。注射FCA 后3～4 h，造模组所有大鼠左后足即可出现红、肿的炎症表现;d 3 左右达到高峰;7 d 左右4 只足爪均有不同程度的肿胀，表明造模成功。

1.3.2 给药方法 模型组、姜黄素组，于7 d 开始腹腔注射给药。模型组给予10% DMSO(美国Sunshine 公司)，5 mg/(kg·d)，连续21 d;姜黄素组给予姜黄素溶液50 mg/(kg·d)，连续21 d;正常组自由饮水。于最后一次姜黄素治疗后24 h，即28 d 用氯胺酮作为麻醉剂，将大鼠仰卧位固定头部、四肢，剥离膝关节滑膜组织，将冰箱温度调节至-80℃保存，利用10%中性甲醛固定液进行固定备检。取左膝关节滑膜固定24 h 后，常规梯度脱水，浸蜡，包埋及切片，切片厚度为4 μm，后行HE 染色，观察炎性细胞的浸润情况及滑膜组织与纤维组织增生情况;对右膝关节滑膜采用Western blot 法检测滑膜RANKL、OPG 蛋白的表达。

1.3.3 大鼠关节滑膜病理的检测 HE 染色，参照文献［4］，具体步骤方法:将滑膜组织固定在10%的中性甲醛溶液固定液(甲醛容量应为标本体积的2至3 倍)→固定24 h 后→常规梯度脱水(从低浓度酒精到高浓度酒精逐级脱水后经二甲苯透明)→浸蜡(将切片放入二甲苯浸泡脱蜡，5～10 min/次，2次)→包埋及切片(切片厚度为4 μm)→后行常规病理HE 染色→苏木素染色5～10 min，细胞核着色→自来水冲掉切片上的染色→1%盐酸乙醇分化5 s→自来水浸洗返蓝→0.5% 的伊红染色1～3 min，胞质着色→逐级脱水从低浓度到高浓度的酒精→二甲苯脱水、透明→中性树胶封片→镜下检查。滑膜病理评分标准，参照文献［5］:炎性细胞评分:0分代表无;1 分代表稀疏，散在;2 分代表较为密集;3分代表大量。纤维组织增生:0 分代表无;1 分代表少量增生;2 分代表中等增生;3 分代表大量增生。滑膜组织增生:0 分代表无;1 分代表单层;2 分代表2 层;3 分代表3 层。

1.3.4 检测指标和方法 分别测定OPG、RANKL表达，严格按照说明书操作:①蛋白样本提取制备:胰酶消化滑膜组织→冷PBS 洗涤2 遍→加入200 μl冰水，预冷裂解缓冲液→混匀后，冰浴30 min→每隔5 min 涡旋震荡10 s→充分裂解→4℃，13 000 r/min离心10 min →将上清分装，将冰箱温度调节至-70℃保存备检;②Western blot:SDS-PAG 的制备:采用5%浓缩胶5 ml［30% Acr/Bis 溶液0.83 ml、1.0 mol/L Tris-HCl (pH6.8)0.63 ml、10% SDS 50 μl、去离子水3.4 ml、10% 过硫酸胺50 μl、TEMED 7 μl］和10% 分离胶10 ml［30%Acr/Bis 溶液3.4 ml，1.5 mol/L Tris-HCl (pH8.8)2.6 ml，10% SDS 100 μl，去离子水3.8 ml，10% 过硫酸胺100 μl，TEMED 7 μl］→将样本用裂解缓冲液稀释相同浓度→取等量上样缓冲液于试管中→蛋白量为70 μg，并于95～100℃5 min 后冰上冷却上样→电泳条件为浓缩胶恒压60V 约20 min→分离胶80V 约80 min→取出凝胶→置于转移缓冲液中平衡15 min→准备滤纸及PVDF 膜→分别置入转移缓冲液及去离子水中→平放底部电极(阳极)→在上面分别放置滤纸、PVDF 膜、凝胶和滤纸，排除各层气泡后将上方电极(阴极)放于夹层物上→按恒流200 mA 通电，电转移1 h→PVDF 膜在封闭液中(5%脱脂奶粉)室温封闭1 h→弃去封闭液，不洗→按约0.1 ml/cm2的量加入封闭液和适量一抗抗体(OPG 测定加入OPG一抗，RANKL 测定加入RANKL 一抗)稀释度均为(1∶200)→摇床摇荡孵育(4℃，过夜)→PBST 漂洗滤膜4 次，每次5 min→将膜与HRP 结合的二抗(辣根过氧化酶标记抗体，二抗用封闭液1∶2 000稀释)室温下摇荡孵育1～2 h→用PBST 充分洗膜，漂洗5次，每次5 min→按0.1 ml/cm2显影液计算用量→将显影液加于PVDF 膜上→室温放置1 min→用保鲜膜将膜包好(尽量避免气泡)→暗室中迅速将膜蛋白贴在X 光胶片上曝光，洗片机中显影、洗像→调整曝光时间，直至出现最佳条带→试验结果以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值的相对值表示。

1.4 统计学分析 采用SPSS17.0 统计软件进行统计学分析。计量资料以±s 表示，多组均数比较采用单因素方差分析，两两比较用LSD 法，若方差不齐则用Tamhane 法。P ＜0.05 差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3 组大鼠滑膜病理的比较 各组大鼠HE 染色后，光镜下发现，正常组滑膜无炎性细胞浸润，衬里层细胞大多呈单层，排列规则，滑膜纤维组织疏松。模型组滑膜出现炎性细胞(淋巴细胞、巨噬细胞等)浸润，衬里层细胞明显增厚，滑膜纤维组织增生明显。姜黄素组存在滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、组织增生，其病理改变较模型组减轻(见图1)。姜黄素组大鼠炎性细胞浸润与模型组比较P=0.000;姜黄素组大鼠纤维细胞增生与模型组比较P=0.000;姜黄素大鼠滑膜细胞增生与模型组比较P=0.000;因此，姜黄素组的大鼠滑膜组织病理较模型组显著改善(P ＜0.01)，见表1。

2.2 3 组大鼠滑膜RANKL、OPG 及其比值的比较 由表2、图2 可见，滑膜RANKL 表达，与正常组大鼠比较，造模组大鼠(模型组、姜黄素组)均显著升高(P ＜0.01);滑膜OPG，与正常组比较，造模组大鼠组均显著降低(P ＜0.01)。姜黄素组大鼠滑膜RANKL 表达与模型组比较P=0.005;姜黄素组大鼠滑膜OPG 表达与模型组比较P=0.001;RANKL/OPG 比值与模型组比较P=0.000;因此，姜黄素组大鼠的滑膜RANKL 表达显著低于模型组，滑膜OPG 表达显著高于模型组，RANKL/OPG 比值显著低于模型组(P ＜0.01)。姜黄素能够降低RANKL表达，提高OPG 表达，改变其比值。

图1 3 组大鼠滑膜病理的比较Fig.1 Comparisons of synovium pathology among three groups

表1 3 组大鼠滑膜关节病理评价(±s，n=10)Tab.1 Pathological comparison of synovium among three groups(±s，n=10)

表1 3 组大鼠滑膜关节病理评价(±s，n=10)Tab.1 Pathological comparison of synovium among three groups(±s，n=10)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal group;2)P ＜0.01，compared with model group.

表2 3 组大鼠滑膜RANKL、OPG 及其比值的比较(±s，n=10)Tab.2 Comparisons of expression of RANKL，OPG in synovium and the RANKL/OPG ratio among three groups(±s，n=10)

表2 3 组大鼠滑膜RANKL、OPG 及其比值的比较(±s，n=10)Tab.2 Comparisons of expression of RANKL，OPG in synovium and the RANKL/OPG ratio among three groups(±s，n=10)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal group;2)P ＜0.01，compared with model group.

图2 3 组大鼠滑膜RANKL/OPG 比值的比较Fig.2 Comparisons of RANKL/OPG ratio in synovium among three groups

3 讨论

RA 是一种世界性自身免疫功能障碍性疾病，以滑膜破坏病变为特征，渐进性的侵蚀软骨和骨，形成骨破坏，最终导致残疾。本实验中采用AA 大鼠模型，它是一种用于RA 最具有代表性的动物研究模型，AA 大鼠造模方法简单，可操作性及重复性强，在AA 大鼠单侧后肢致敏后，发生红、肿、热、痛，对侧也会继发性发生肿胀，且大鼠表现出免疫功能紊乱，AA 大鼠模型造模后存在化膜病变，渐进性骨丢失，随着病程进行性加重，病理表现类似于RA［6］。本实验观察到，AA 大鼠模型，造模后28 d存在滑膜病理改变，炎性细胞(淋巴细胞、巨噬细胞等)浸润，衬里层细胞明显增厚，滑膜纤维组织增生明显;且滑膜RANKL 表达明显增加，OPG 的表达明显降低。

OPG 是分泌型蛋白，目前发现OPG mRNA 在骨骼、肾、甲状腺、脑、肺、心脏、胃肠、脊髓和肝脏均有表达，但发生生理功能的部位不一定就是表达的部位。研究发现OPG 敲除小鼠，出现B 细胞成熟障碍，并伴有明显骨丢失，骨微结构的破坏，表现出骨质疏松易骨折［7］。RANKL 是一种跨膜蛋白，是破骨细胞形成、融合、分化所必需的细胞因子，在破骨细胞介导的RA 骨侵蚀中起着重要的关键作用。骨、骨髓中有高表达RANKL mRNA，在骨骼具有促进破骨细胞分化和保持其活性的功能，是破骨细胞调节的中枢。实验研究发现，RANKL 敲除小鼠出现严重的骨硬化、OC 缺乏、淋巴结缺乏，在早期T、B 细胞分化中出现严重的缺陷，胸腺、乳腺发育缺陷，最终导致小鼠死亡［8］。RANK 属于Ⅰ型跨膜蛋白，RANK 敲除小鼠出现与RANKL 敲除小鼠相似的表现，因缺乏破骨细胞表现出严重的骨硬化，淋巴结缺乏，B、T 细胞分化缺陷，但胸腺发育是正常的［9］。在正常的骨重建过程中，RANKL 蛋白结合RANK，促使破骨细胞的生成，保持其活性，促进骨的吸收功能。当骨的吸收大于骨的形成时，成骨细胞系自动分泌更多的OPG，假性受体竞争结合RANKL，阻止RANKL 与受体RANK 结合，抑制破骨细胞生成、活化，抑制骨吸收功能，使骨吸收与骨形成又处于一个相对稳定的状态。

姜黄素具有广泛的生物学功能，作用具有多靶点，多通路，具有免疫调节作用，能够调节T 细胞、B细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等的活性［10，11］。为了进一步探讨姜黄素对RA 的治疗作用，设计实验，观察姜黄素对AA 大鼠滑膜病理及RANKL、OPG 表达影响。本实验中观察到AA 大鼠滑膜病理的影响，姜黄素能明显改善AA 大鼠滑膜病理学损伤，减轻滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、组织增生等表现。并且在姜黄素治疗21 d 后，与模型组比较，滑膜上RANKL 表达明显降低，OPG 表达明显提高，其比值明显降低。OPG/RANKL 的比值是最终决定骨质变化方向的因素，比率减少，骨质则流失增多，比率增大时，骨质则丢失减少。OPG/RANKL 表达的相对平衡是RA 是否骨破坏的关键因素，被提议作为反映骨和软骨的破坏预测，来评估RA 的预后［12］。由此可见，姜黄素能够上调AA 大鼠滑膜OPG 的表达，下调滑膜RANKL 的表达，从而调节RANKL/OPG 的比值，参与调控OPG/RANKL信号通路，来发挥对RA 的治疗作用，并改善其预后。

姜黄素是传统中药的有效提取物，具有安全性高，价格便宜等优点。姜黄素不仅能够改善AA 大鼠关节滑膜病理学损伤，还可调节滑膜RANKL/OPG 的比值，进一步研究姜黄素，为姜黄素用于RA临床提供实验依据。

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