硫酸脑苷酯活化Ⅱ型NKT 细胞对哮喘小鼠气道炎症的影响①

何 青 杨巧玉 刘 敏 聂汉祥 张固琴 丁续红 黄 毅 余红缨

(武汉大学人民医院呼吸内科，武汉430060)

自然杀伤(Natural killer，NK)T 细胞是一群独特和数量较少的淋巴细胞亚群，分为Ⅰ型NKT 细胞和Ⅱ型NKT 细胞，两者之间存在相互调节作用［1］。硫酸脑苷酯是来源于髓磷脂的一种脂类物质，可以被Ⅱ型NKT 细胞的T 细胞受体(TCRs)特异性识别，并活化Ⅱ型NKT 细胞［2］。我们的初步研究显示硫酸脑苷酯可以抑制哮喘小鼠气道炎症［3］，但机制尚不清楚。因此，我们观察硫酸脑苷酯对哮喘小鼠肺Ⅱ型NKT 细胞数量和活性的影响，并了解过继转移硫酸脑苷酯活化的Ⅱ型NKT 细胞对哮喘小鼠气道炎症的影响，探讨硫酸脑苷酯抑制哮喘小鼠气道炎症的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 6 周龄健康雌性BALB/c 小鼠购自武汉大学实验动物中心，无特定病原菌(SPF)环境饲养。鸡卵清白蛋白(OVA，Grade，V)和氢氧化铝凝胶(美国Sigma 公司)，硫酸脑苷酯(美国Matreya 公司)，IL-4 和IL-5 ELISA 试剂盒(美国Ebioscience 公司)，大鼠抗小鼠IgE 抗体(美国Biolegend 公司)，亲和素连接的辣根过氧化物酶(美国Sigma 公司)，小鼠CD1d 单体由美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)赠送。

1.2 小鼠分组与哮喘模型的建立 32 只BALB/c小鼠按随机数字表法随机分为对照组、哮喘组、硫酸脑苷酯治疗组和过继转移组，每组8 只。建立小鼠哮喘模型的方法为:哮喘组、硫酸脑苷酯治疗组和过继转移组小鼠于第0 天和第7 天腹腔注射含100 μg OVA 和20 μg 氢氧化铝凝胶的PBS 200 μl，并于第25 天、第26 天和第27 天以1%戊巴比妥钠麻醉，使用含100 μg OVA 的PBS 50 μl 鼻腔滴入。正常对照组小鼠在相应时间内腹腔注射等量的PBS 并以PBS 鼻腔滴入。

1.3 硫酸脑苷酯/CD1d 四聚体的制备 参照文献［4］制备硫酸脑苷酯/CD1d 四聚体。将硫酸脑苷酯溶于含0.5%Tween20 的PBS 中，硫酸脑苷酯与生物素连接的CD1d 单体按摩尔比3∶1混合室温静置过夜;第2 天按每200 μg 硫酸脑苷酯/CD1d 混合物中加入80 μg PE 标记的链酶亲和素，室温避光4 h后获得PE 标记的硫酸脑苷酯/CD1d 四聚体，于4℃避光保存备用。

1.4 硫酸脑苷酯治疗方法 硫酸脑苷酯治疗组小鼠于第25 天鼻腔滴入OVA 前1 h 每只小鼠腹腔注射含硫酸脑苷酯20 μg 的PBS 200 μl。

1.5 硫酸脑苷酯体外活化Ⅱ型NKT 细胞的制备与过继转移 参照文献［4］将正常小鼠脾单个核细胞制备成单细胞悬液，按1 ×107个/孔在六孔板中培养，每孔加入1640 完全培养基3 ml。正常小鼠脾细胞经硫酸脑苷酯刺激3 h 后流式细胞仪分选Ⅱ型NKT 细胞(Sulfatide/CD1d 四聚体+TCR-β+细胞)。于第25 天OVA 激发前1 h，将硫酸脑苷酯体外活化的Ⅱ型NKT 细胞经尾静脉注射到过继转移组小鼠体内，每只注入3 ×106个。

1.6 标本的收集和处理与细胞学、组织学检测 各组小鼠于末次激发48 h 后眼球取血2 ml，分离血清分装，-80℃保存，用于检测血清OVA 特异性IgE。随后分离气管，插入套管针，暴露胸腔，结扎右肺门，用含1 mmol/L EDTA 的冷PBS 0.5 ml 灌洗，每次在肺内停留30 s，回抽灌洗液，共3 次，回抽率在80%以上视为成功。支气管肺泡灌洗液(BALF)在4℃下1 500 r/min 离心5 min，收集上清液，-80℃保存，用于检测IL-4 和IL-5 水平。用含1% BSA 的PBS 重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为1 ×106ml-1，取100 μl 细胞悬液离心涂片，姬姆萨染色检测各细胞分类计数。取右肺组织，充分切碎，Ⅰ型胶原酶消化，通过50 μm 细胞滤网过滤获得肺组织单细胞混悬液，以密度梯度离心法分离肺组织单细胞混悬液中单个核细胞(MNCs)，调整浓度为1 ×106ml-1，以流式细胞液检测硫酸脑苷酯/小鼠CD1d 四聚体+TCR-β+细胞(Ⅱ型NKT 细胞)以及IL-4+和IFN-γ+硫酸脑苷酯/小鼠CD1d 四聚体+TCR-β+细胞(IL-4+和IFN-γ+Ⅱ型NKT 细胞)的百分比。取左肺组织，以10%中性甲醛溶液固定，常规石蜡包埋、切片，HE 和PAS 染色，观察肺组织炎症和气道基底膜PAS+细胞(杯状细胞)。

1.7 血清OVA 特异性IgE 以及BALF 中细胞因子的检测 采用ELISA 法检测小鼠血清OVA 特异性IgE 的水平，结果以OD 值表示为相对水平，其检测步骤简述如下:96 孔板每孔加入200 μg/ml 的OVA 50 μl，37℃，1 h;洗板1 次，每孔加含10%血清的PBS，200 μl 每孔，37℃，1 h;洗板1 次，加待测血清，4℃，过夜;洗板6 次，每孔加入0.5 μg/ml 的生物素连接的大鼠抗小鼠IgE 抗体100 μl，室温，1 h;洗板6 次，每孔加入亲和素连接的辣根过氧化物酶(按说明书稀释)100 μl，室温，1 h;洗板6 次，每孔加入100 μl TMB，室温，15 min;每孔加入50 μl 终止液，450 nm 波长读数得到各孔OD 值。参考试剂说明书，采用ELISA 法检测BALF 中的IL-4 和IL-5 的水平。

1.8 统计学处理 应用SPSS13.0 软件进行统计分析。数据以±s 表示，采用单因素方差分析，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组HE 和PAS 染色 对照组小鼠肺组织无炎症表现，气道基底膜无PAS+细胞;哮喘组小鼠肺组织炎症浸润明显，气道基底膜可见大量PAS+细胞;硫酸脑苷酯治疗组和过继转移组小鼠肺组织炎症浸润减轻，气道基底膜PAS+细胞减少(图1)。

2.2 各组小鼠BALF 中细胞分类百分比比较 硫酸脑苷酯治疗组和过继转移组小鼠BALF 中嗜酸性粒细胞百分比明显低于哮喘组(均P ＜0.01);但明显高于对照组(均P ＜0.01)(表1，图2)。

图1 各组小鼠肺组织病理表现Fig.1 Lung tissue pathology of mice in each group

表1 各组BALF 中各细胞分类百分比比较(n=8，±s，%)Tab.1 Comparison of percentages of differential cell counts in BALF between each group(n=8，±s，%)

表1 各组BALF 中各细胞分类百分比比较(n=8，±s，%)Tab.1 Comparison of percentages of differential cell counts in BALF between each group(n=8，±s，%)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal control group;2)P ＜0.05，3)P ＜0.01，compared with asthma group.

图2 各组小鼠肺泡灌洗液中细胞分类比较Fig.2 Comparison of percentages of differential cell counts in BALF between each group

2.3 各组小鼠血清OVA 特异性IgE 和BALF 中IL-4、IL-5 水平 对照组小鼠血清中未检测到OVA 特异性IgE。硫酸脑苷酯治疗组和过继转移组小鼠血清OVA 特异性IgE 的OD 值分别为(0.397 2±0.116 8)和(0.423 2±0.060 7)，明显低于哮喘组(0.603 8±0.123 1)(均P ＜0.01)。硫酸脑苷酯治疗组和过继转移组小鼠BALF 中IL-4 和IL-5 水平明显低于哮喘组(均P ＜0.05)，但明显高于对照组(均P ＜0.01)(表2)。

2.4 硫酸脑苷酯治疗组与正常对照组、哮喘组小鼠肺Ⅱ型NKT 细胞的百分比和活性 硫酸脑苷酯治疗组小鼠肺Ⅱ型NKT 细胞百分比与哮喘组和对照组比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。以分泌细胞因子的水平表示肺Ⅱ型NKT 细胞的活性，硫酸脑苷酯治疗组小鼠肺IL-4+和IFN-γ+Ⅱ型NKT 细胞的百分比明显高于对照组和哮喘组(均P ＜0.01)(图3、4，表3)。

表2 各组BALF 中IL-4、IL-5 水平比较(n=8，±s，pg/ml)Tab.2 Comparison levels of IL-4 and IL-5 in BALF between each group(n=8，±s，pg/ml)

表2 各组BALF 中IL-4、IL-5 水平比较(n=8，±s，pg/ml)Tab.2 Comparison levels of IL-4 and IL-5 in BALF between each group(n=8，±s，pg/ml)

Note:1)P ＜0.01，compared with normal control group;2)P ＜0.05，3)P ＜0.01，compared with asthma group.

图3 肺Ⅱ型NKT 细胞占肺MNCs 的百分比比较Fig.3 Comparison of percentage of type ⅡNKT cells in lung mononuclear cells(MNCs)between each group

图4 肺IL-4 +和IFN-γ+Ⅱ型NKT 细胞占肺Ⅱ型NKT 细胞的百分比比较Fig.4 Comparison of percentages of IL-4 + type ⅡNKT cells and IFN-γ+ NKT cells in lung type ⅡNKT cells

表3 各组肺MNCs 中Ⅱ型NKT 细胞、IL-4 +和IFN-γ+Ⅱ型NKT 细胞的百分比(n=8，±s，%)Tab.3 Comparison of percentages of type ⅡNKT cells，IL-4 +type ⅡNKT cells and IFN-γ+type ⅡNKT cells between each group(n=8，±s，%)

表3 各组肺MNCs 中Ⅱ型NKT 细胞、IL-4 +和IFN-γ+Ⅱ型NKT 细胞的百分比(n=8，±s，%)Tab.3 Comparison of percentages of type ⅡNKT cells，IL-4 +type ⅡNKT cells and IFN-γ+type ⅡNKT cells between each group(n=8，±s，%)

Note:1)P ＜ 0.01，compared with normal control group;2)P ＜ 0.01，compared with asthma group.

3 讨论

硫酸脑苷酯(Sulfatide)，即3'硫酸半乳糖神经酰胺(3'-sulfated galactosyl ceramide)是来源于髓磷脂的一种脂类物质，由Ⅱ型NKT 细胞的TCRs 识别，硫酸脑苷酯可以活化大部分Ⅱ型NKT 细胞［2］。Jahng等［5］研究发现实验性自身免疫性脑脊髓炎鼠模型中枢神经系统组织中硫酸脑苷酯反应性NKT 细胞数量增高;硫酸脑苷酯活化Ⅱ型NKT 细胞防止野生鼠产生抗原诱导的实验性自身免疫性脑脊髓炎。Halder 等［6］研究发现硫酸脑苷酯活化ConA 诱导性肝炎小鼠肝组织Ⅱ型NKT 细胞可以诱导Ⅰ型NKT细胞免疫无能，防止炎症性肝病的形成。我们的初步研究发现硫酸脑苷酯可以减轻哮喘小鼠肺组织炎症浸润［3］。本研究发现硫酸脑苷酯治疗组哮喘小鼠肺组织炎症浸润减轻，气道基底膜PAS+细胞(杯状细胞)减少，BALF 中嗜酸性粒细胞百分比明显减少，血清OVA 特异性IgE 和BALF 中IL-4、IL-5 水平降低，同时肺IL-4+和IFN-γ+Ⅱ型NKT 细胞的数量明显高于对照组和哮喘组，结果提示硫酸脑苷酯可以抑制哮喘小鼠气道炎症，同时伴随肺Ⅱ型NKT 细胞活化。进一步观察发现过继转移硫酸脑苷酯体外活化的Ⅱ型NKT 细胞可以明显抑制哮喘小鼠气道炎症，表现为肺组织炎性细胞浸润和气道基底膜PAS+细胞减少;BALF 中的嗜酸性粒细胞百分比明显降低;BALF 中IL-4、IL-5 的水平和血清OVA 特异性IgE 的水平明显降低。上述研究说明硫酸脑苷酯可能通过活化Ⅱ型NKT 细胞抑制哮喘小鼠气道炎症。

硫酸脑苷酯活化的Ⅱ型NKT 细胞抑制哮喘小鼠气道炎症的机制尚不清楚。NKT 细胞分为Ⅰ型NKT 细胞和Ⅱ型NKT 细胞，两者之间存在相互调节［1］。目前认为Ⅰ型NKT 细胞参与哮喘气道高反应性和气道炎症的形成［7］。硫酸脑苷酯活化的Ⅱ型NKT 细胞通过调节Ⅰ型NKT 细胞的功能抑制肝脏和肾脏的缺血再灌注损伤以及ConA 诱导的炎症性肝病的炎症反应［6，8，9］。因此，我们推测硫酸脑苷酯活化的Ⅱ型NKT 细胞可能通过调节Ⅰ型NKT 细胞的功能抑制哮喘小鼠的气道炎症。研究发现硫酸脑苷酯活化的Ⅱ型NKT 细胞可以调节炎症性肝病鼠模型和非肥胖小鼠Ⅰ型糖尿病模型树突状细胞的功能［6，10］。由于Ⅰ型NKT 细胞需要树突状细胞的CD1d 分子递呈脂类抗原诱导其活化［11］。因此，我们推测硫酸脑苷酯活化的Ⅱ型NKT 细胞可能通过调节树突状细胞的功能抑制Ⅰ型NKT 细胞的活化进一步影响哮喘小鼠气道炎症，但需进一步研究。

综上所述，硫酸脑苷酯可以抑制哮喘小鼠气道炎症，可能由其活化肺Ⅱ型NKT 细胞所致。因此，激活哮喘肺Ⅱ型NKT 细胞可能成为哮喘治疗的新靶点。

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