脂质筏神经鞘磷脂在T 细胞活化中的作用①

黄成日 (延边大学附属医院妇产科，延吉 133000)

机体通过正确地调节活化免疫细胞的信号传递，抵抗入侵的病原微生物。其中获得性免疫起主要作用，主体为T 淋巴细胞或B 淋巴细胞。细胞膜上的T 细胞受体集中在免疫突触的中央，与抗原提呈细胞结合形成免疫突触［1］。1972 年Nicolson 提出细胞膜液态镶嵌模型，当时这一重大发现在学界引起了轰动。随着对细胞膜研究的深入，近年，脂质组学逐渐受到了关注。1997 年Simons 和Ikonen 提出了［由神经鞘脂质和胆固醇形成的区域叫脂质筏，它在细胞黏附和运输膜蛋白的过程中发挥重要作用］的筏模型［2］。2001 年，在西班牙召开的欧洲生物科学研讨会上正式提出了“脂质筏(Lipid Raft)”的概念。脂质筏是细胞膜上的功能微区，可以在膜中侧向流动、聚集，从而完成信号转导、物质转运等功能。脂质筏对维持T 细胞稳态发挥重要作用，认清T 细胞活化与脂质筏的密切关系有着重要意义。研究表明，改变脂质筏的完整性会影响T细胞的功能，引起各种疾病。神经鞘磷脂(Sphingomyelin，SM)是脂质筏的主要构成成分，在细胞膜上跨膜信号转导中发挥重要作用。本文主要对脂质筏SM 在T 细胞活化中的作用进行综述。

1 脂质筏的结构

脂质筏存在于细胞生物膜上的特殊微区(microdomain)，不被去垢剂溶解，又称detergent resistant fractions(DRF)［3］。这些由磷脂质、鞘磷脂和胆固醇组成的脂质将细胞膜分为功能不同的区域，保持一种液态有序相，不溶于去垢剂。这个区有许多名称:不溶于去垢剂的糖脂富含区(Detergent-insoluble glycolipid-rich domain，DIGs)，不溶于去垢剂的膜(Detergent resistant membrane，DRMs)，富含糖脂的膜(Glycolipid-rich membrane，GEMs)，Triton 不溶复合物(Triton insoluble complexes，TIC)［4］。脂质筏富含胆固醇和鞘脂，包括鞘磷脂和鞘糖脂(glycolsphingolipids)，如神经节苷脂GM1、GM2、GM3 等。并有特定的蛋白质，如GPI(糖基磷脂酰肌醇)锚定蛋白等信号转导蛋白，TCR、BCR、生长因子等跨膜转运蛋白和功能蛋白;以及一些标记蛋白caveolin、flotillin、stomatin 等。目前脂质筏分为小窝、富含糖鞘脂膜区、富含多磷酸肌醇膜区三种类型，不同类型含有某些特有的蛋白质，故将这些蛋白称为标记蛋白，如caveolin 是caveolae 上的标记蛋白，flotillin、stomatin是富含PIP2 膜区的标记蛋白［5］。鞘糖脂中GM1 是神经节苷脂的一种，相对分子量为11 500，因其能与霍乱毒素-B 亚基特异性的结合，常作为脂质筏的标记分子。到目前为止对筏的鉴定是以筏中的GM1的霍乱毒素B 亚基(cholera toxin B subunit;CTx)为探针进行分析的。筏的功能解析是用甲基-β-环湖精(methyl-β-cyclodextrin;MβCD)来进行的［6］。但是，对脂质筏的主要构成成分的SM 的解析报道甚少。

通常，因为磷脂质具有氢受体(Hydrogen acceptor)，不具有供氢体(Hydrogen donor)，因而磷脂质之间不易结合，含多加不饱和脂肪酸的部分不对称，不易形成联网状态。但是，饱和脂肪酸的SM 具有与氢结合必需的氢受体和供氢体，因而脂质双层结构中容易形成联网状态。其脂质分配是不均一的，维持着非对称性。即具有头部胆碱的SM 或磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine，PC)等的饱和磷脂质存在于细胞膜双重结构的外层(Exoplasmic leaflet);磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine，PS)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidylethanolamine，PE)或 磷 脂 酰 肌 醇(Phosphatidylinositol，PI)等的不饱和磷脂质存在于内层(Cytoplasmic leaflet)。胆固醇则填充脂质双层间隙之中［7］，通过酰基(acyl)链结合于SM，填补SM 间隙。这就是筏的实体，SM 和胆固醇密集的区域［6，8］。到目前为止已知的Ras 还有很多的酪氨酸激酶、接头蛋白等各种信号传导物质聚集在筏(表1)。TCR的信号传导为由通过聚集在筏的Lck 或Fyn 等酪氨酸激酶或LAT(linker for activation of T cells)信号传导来实现的。

前面已提到生物膜上存在由脂质构成的不同的微结构域和神经鞘脂质密集的细胞膜外层区域在细胞黏着或活化时起运输膜蛋白的作用。可见膜脂质不是生物膜静止的构成成分，而是动态移动，将情报提供给各种各样的功能分子的汇合或集聚部位，而转导重要的信号。

2 脂质筏的功能

脂质筏是蛋白质和脂质停留和活动的平台。脂质筏在整个信号转导过程中起到一个平台的作用。细胞受刺激时，筏中的SM 迅速相互联结凝集成更大的微结构区，这些结构又可以迅速形成一个或多个平台。这个过程可以理解成脂质筏由小的、无活性的状态转化为大的、有活性的状态，即平台的形成。脂质筏选择性地聚集不同的蛋白质于细胞膜的两侧，脂质筏中的脂质对其进行修饰使蛋白嵌入脂质筏中。脂质筏在膜中侧向流动可使多种距离较远的蛋白质聚集在脂质筏内，便于信号转导［9］。脂质筏还参与信使的形成、跨膜转运、突触传递、细胞膜非对称性的维持、抗肿瘤、抗感染、细胞的增殖与凋亡及胰岛素调节等［10，11］。

表1 筏中局限或集聚的分子Tab.1 Localized molecules cluster in raft

3 T 细胞活化与脂质筏

T 细胞活化需要两个信号:第一信号的产生依赖于TCR 与抗原提呈细胞(APC)所提呈的抗原肽-主要组织相容性复合体(MHC)复合物特异性结合，第二信号则来自于共刺激信号。APC 将共刺激分子(B7-1、B7-2、VCAM、ICAM、LFA 等)抗原提呈给特异性T 细胞，两种细胞表面黏附因子围绕TCR/抗原肽-MHC 凝聚，形成一狭小空间，即免疫突触。突触中存在一个由TCR 为中心族聚集而成的中央超分子活化簇［12］。

1998 年，美国癌研究所Samelson 等［13］研究人员发现linker for activation of cell(LAT)，阐明LAT 是局限在筏的结合蛋白，首次论证TCR 信号与筏的关系。TCR 与抗原肽-MHC 复合物特异性结合时，引起TCR 交联。TCR 交联时，TCR 复合物中的CD3、CD4 等膜分子发生聚集，CD3ξ 链的 immunoreceptor tyrosine-based activation motif(ITAM)受到磷酸化，磷酸化ITAM 里结合Syk 酪氨酸激酶属的ZAP-70 后，与Lck 协同作用下酪氨酸磷酸化LAT、SLP-76 等结合蛋白。进而，通过磷酸化LAT、SLP-76、PLC-γ、Grb2、PI-3kinase、Cbl、Vav、SKP-76等的信号因子聚集在筏里［13］(图1)。LAT 以后的信号途径是Grb2 或SOS→Ras，Gads，SLP-76;Vav→Rac/cdc42;Nck，Wasp→肌动蛋白聚合;PLC-γ，Gads，SLP-76 →流入到细胞内。伴随着T 细胞活化，以LAT 为首的重要的激酶或结合蛋白和TCR 自身集聚在筏。但是，LAT 一直局限于筏中而TCR 是未受到刺激时不存在于筏中。那么，什么时间段和以什么方式TCR 移动到筏，尚不清楚。最近还有一种报道称，TCR 在筏中凝聚之前或微小群集形成时TCR活化信号传递到LAT，其机制尚不清楚。［12，14］

4 靶向神经鞘磷脂的脂质筏解析的新策略

越来越多的研究显示，神经酰胺作为细胞内信号传导的第二信使，在肿瘤细胞增殖、信号传递、蛋白质相互作用、黏附和凋亡中发挥很重要的作用。SM/神经酰胺循环如下:SMase(Sphingomyelinase)促进SM 水解神经酰胺磷脂酰胆碱为神经酰胺和磷脂酰胆碱。神经酰胺酶(Ceramidase)分解神经酰胺形成神经鞘氨醇(Sphingosine)。神经酰胺在SMS作用下可转变为SM。神经酰胺重新合成开始于内质网的丝氨酸软脂酰转移酶催化的丝氨酸和软脂酰-CoA 凝集，随后的一系列反应产生ER 细胞质内神经酰胺。如此，存在于细胞膜脂质双重结构外叶的SM 和细胞质内的神经酰胺之间形成SM/神经酰胺周期，日常维持平衡(见图1)。这种SM-神经酰胺途径介导的信号传导已被证实是广泛存在的。

图1 神经鞘磷脂/神经酰胺代谢示意图Fig.1 Schematic diagram of sphingomyelin and ceramide metabolism

很多一流杂志上刊登了有关脂质筏的论文。但是，到目前为止对筏的检测是以筏中的GM1 的霍乱毒素B 亚单位为探针进行分析的。筏的功能解析是用MβCD 破坏筏的方法进行的。但是，对脂质筏的主要构成成分的SM 的解析几乎没有报道。因为没有发现神经鞘磷脂合成酶(Sphingomyelin synthesis;SMS)基因，所以SM 合成经路或SM 可视化方法没确立下来。我们研究小组克隆神经鞘磷脂合成酶基因SMS1、SMS2 和SMS3，并发现SM 特异性结合的标志物lysenin。用lysenin 的敏感性来确定细胞膜的SM。

我们将SMS1 基因转入到无SM 的细胞株［WR/Fas-SM(-)］使其成为存在SM 的细胞株［WR/Fas-SMS1］。两者Fas 表达量及细胞膜胆固醇与神经节苷脂GM1 的量同等，但用lysenin 鉴定时只有WR/Fas-SMS1 表达SM。利用两者首次阐明在筏的集聚或凋亡中的SM 的重要性［15］。

5 SM 沉默的细胞株和敲除小鼠模型的制备及解析

SM 是脂质筏的重要构成成分，分布于细胞膜脂质双层结构的外层，发挥维持脂质双层结构的对称性的作用，作为脂质筏的标志物与神经节苷脂GM1 发挥同样的重要作用。所以，我们将神经鞘磷脂酶基因SMS1-siRNA 转染于jurkat T 细胞，建立SM 沉默的细胞株，分析其TCR 信号及细胞活化可见沉默细胞的T 细胞功能显著下降［16］。CD69 是早期的白血球活化抗原，反映细胞免疫功能的标志物。正常的T 细胞受TCR/CD3 或CD3/CD28 的刺激时，逐渐地表达于细胞表面，受刺激6 h 开始出现，48 h 达到高峰，其后逐渐减弱，最后消失。表达CD69 需要T 细胞的膜结构和转导TCR/CD3 信息传导通路，才能将CD69 蛋白质运输到细胞膜。用Phorbol 12-myristate 13-acetate(PMA)刺激时沉默细胞和对照组细胞表达同等量的CD69，但是用CD3交联刺激时在沉默细胞中显著的减少。结果显示神经鞘磷脂与TCR/CD3 诱导的CD69 表达密切相关［16］。

CD3/TCR 信号活化途径有经LAT 传导途径和经PI3K 传导途径两种。我们转入Jurkat T 细胞SMS1 的si-RNA 建立SM knockdown 细胞株，用蛋白印迹分析CD3 交联刺激时ZAP-70 和LAT 及PKCθ的磷酸化，沉默细胞中ZAP-70 和LAT 及PKCθ 的磷酸化比对照细胞明显地降低。说明细胞膜SM 是筏的重要成分而且在TCR 介导的T 细胞活化过程中发挥重要作用［9］。制备SM 敲除老鼠，用伴刀豆蛋白诱导肝炎时SM 敲除老鼠CD4+T 细胞功能明显下降［16］。脂质筏鞘磷脂通过CXCL12/CXCR4 途径减小相应的信号传递，调节细胞迁移［17］。

因此SM 与免疫担当细胞活化或细胞死亡密切相关，临床上与自身免疫性疾病、变态反应性疾病的免疫异常、细菌或病毒感染性疾病，脏器移植或肿瘤排斥密切相关［18，19］。

6 结语与展望

随着对脂质筏研究的深入，对细胞膜上的微区结构逐渐清晰，但是仍然存在很多问题需要解决:①脂质筏作为一种膜上微结构是否存在于所有生物膜上?②通过脂质筏的研究能否阻止病原体的入侵?③能否在脂质筏的角度提高肿瘤细胞对肿瘤药物的敏感性或直接杀死肿瘤细胞?④脂质筏在参与信号转导机制并不清楚。

近年，生物膜领域细胞膜脂质双层结构的细胞膜外层和内层脂质分布不均，确立了其非对称性(asymmetry)正是细胞膜的重要概念。且对生物膜的功能和raft 特性进行比较广泛的研究。但是，为了更加客观、更加自然的状态上观察空间和时间上变化的细胞膜，期待开发相应的研究方法和工具。因为Raft 的解析也存在技术上有限，对生物化学和生物物理的解析结果的评价存在不同的看法。

今后我们将进一步对①生物膜领域细胞膜脂质双层结构的细胞膜外层和内层脂质分布不均一性，非对称性破坏为诱因的免疫细胞功能异常;②SM/神经酰胺平衡的破坏为诱因的细胞的生存和死亡的信号传导;③SMS1 敲除老鼠的自身免疫性疾病、肿瘤或感染疾病的发生;④利用SM 的调节的方法对免疫抑制剂，抗癌药物的开发进行解析。

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