芍药苷对牛Ⅱ型胶原诱导的小鼠关节炎模型T 细胞作用机制研究①

蔡 力 张 晗 齐渊元 张立丽 黄晓婉 聂 红

(上海交通大学医学院，上海市免疫学研究所，上海 200025)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节软骨病变、滑膜细胞增生为特征的系统性、炎性自身免疫性疾病［1］。RA 的病因和发病机制尚不明确，目前认为是相关基因、环境等因素共同作用引起，细胞因子及免疫细胞的调节失衡是其病理发病过程的中心环节［2］，其中自身反应性T 细胞在RA 发病过程中起重要作用［3］。目前RA 药物治疗主要包括非甾体类抗炎药、抗风湿药、免疫抑制剂、免疫和生物制剂等，但往往治疗效果局限或有严重副作用［4］。作为中国瑰宝，传统中药如白芍总苷(Total glucosides of paeony，TGP)已在临床使用，并且对RA 具有较好疗效。芍药苷(Paeoniflorin，PF)是白芍总苷的单体提取物，含量超过90%，与白芍总苷相比具有易溶于水、易量化等特点，同时也具有扩张动脉血管、解痉镇痛、抗炎抗溃疡、调节血糖、免疫调节、护肝、抗肿瘤等作用［5］。本研究采用牛Ⅱ型胶原诱导的CIA(Collagen-induced arthritis)小鼠模型，观察PF 治疗CIA 的疗效，探讨其在自身反应性T 细胞方面的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级DBA/1J 小鼠(雄性，18～20 g，8～10 周)购于上海斯莱克实验动物有限公司［SCK(沪)2012-0002］，饲养于上海交通大学医学院动物科学部屏障环境内，伦理学审核编号:2014039。

1.1.2 主要药物及试剂 牛Ⅱ型胶原蛋白(Collagen Ⅱ，CII，Chondrex 公司，USA);完全弗氏佐剂(Complete freund’s adjuvant，CFA)和不完全弗氏佐剂(Incomplete freund’s adjuvant，IFA)(Sigma 公司，USA);冰乙酸(上海试剂四场昆山分厂);芍药苷(PF，上海一林生物科技有限公司，纯度≥95%);Mouse CD4 (L3T4)MicroBeads 和mouse/human CD11b MicroBeads(Miltenyi Biotec 公司，Germany);Anti-mouse CD3 Functional Grade Purified 和Antimouse CD28 Functional Grade Purified(eBioscience，USA);流式荧光抗体Anti-mouse CD4、Anti-mouse IL-17、Anti-mouse IFN-γ、Cell Stimulation Cocktail(plus protein transport inhibitors)(500 ×)(eBioscience，USA);IFN-γ、IL-17 酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(R＆D 公司，USA)。

1.2 方法

1.2.1 CIA 模型建立和分组干预 用0.05 mol/L冰乙酸溶解CII 至3 mg/ml，4℃搅拌过夜，次日取CII 与等体积CFA 充分乳化(冰上操作)至油包水状态，使胶原浓度为1.5 mg/ml;初次免疫时，于DBA/1J 小鼠尾根部皮下2～3 cm 处注射100 μl 乳化胶原;第21 天，取CII 与等体积IFA 充分乳化(冰上操作)至油包水状态，使胶原浓度为1.5 mg/ml，于相同位置注射50 μl 乳化胶原加强免疫。第21 天，模型小鼠随机分为对照组(Vehicle 组，1 × PBS，即Phosphate Buffered Saline，200 μl/d)和治疗组(PF组，7.5 mg/kg·d)，腹腔注射，每组8 只，至第46 天处死，检测各项指标。

1.2.2 CIA 评分标准 0 分:无红肿;1 分:局限的足或踝关节轻度红肿;2 分:关节和足趾轻度肿胀;3分:足趾和踝关节全部肿胀;4 分:踝关节至全爪红肿或关节畸形，每只小鼠四肢评分相加总评分为小鼠关节炎指数。

1.2.3 病理学切片 取小鼠膝关节固定、脱钙、石蜡包埋，常规切片做苏木精-伊红(HE)染色，显微镜下观察炎性细胞浸润情况。

1.2.4 淋巴细胞增殖 发病高峰期处死小鼠，取脾脏，用200 目cell strainer 制备成单个核细胞悬液后接种于96 孔圆底板，每组3 复孔，每孔0.5 ×106个细胞，用CII(40 μg/ml)或anti-CD3/28 Functional Grade Purified(1 μg/ml)刺激。细胞在含5%CO2的37℃培养箱中培养72 h，最后16 h 每孔加入0.5 μCi3H-TdR。培养时间到达后，将细胞转移到玻璃纤维素膜，读取cpm 值，检测掺入全脾细胞的3HTdR 量，以评价两组全脾细胞增殖程度。

CD4 (L3T4)MicroBeads 分选两组脾脏细胞的CD4+T 细胞，接种于96 孔圆底板，每组3 复孔，每孔0.5 ×106个细胞，anti-CD3/28 Functional Grade Purified(1 μg/ml)刺激，用同上方法检测掺入CD4+T 细胞的3H-TdR 量，以评价两组CD4+T 细胞增殖程度。

CD11b MicroBeads 分选Naive 鼠脾脏中的CD11b+细胞，按照1∶3比例分别与对照组和治疗组CD4+T 细胞共培养，每组三复孔，每孔共0.5 ×106个细胞，CII(40 μg/ml)刺激，用同上方法检测掺入细胞的3H-TdR 量，以评价两组共培养体系中T 细胞增殖程度。

1.2.5 脾脏细胞中Th1/Th17 细胞亚群比例 脾脏细胞接种于96 孔圆底板，每孔0.5 ×106个细胞，加入Cell Stimulation Cocktail (plus protein transport inhibitors)(500 ×)后在5%CO2的37℃培养箱中培养5 h，细胞重悬于100 μl FACS Buffer，首先与FITC-anti-mouse CD4 孵育30 min，FACS Buffer 洗涤后，按BD 公司Cytofix/Cytoperm Plus kit 说明书破膜固定，与PE-anti-mouse IL-17 和APC-anti-mouse-IFN-γ 孵育30 min，洗涤后加流式缓冲液重悬细胞，FACS Canto Ⅱ检测分析。

1.2.6 脾脏细胞培养上清细胞因子含量 各组脾脏细胞接种于96 孔圆底板，每组3 复孔，每孔1.5×106个细胞，用CII(40 μg/ml)刺激。细胞在含5%CO2的37℃培养箱中培养48 h 后，收集培养上清，ELISA 法检测上清中IFN-γ、IL-17 的含量。

2 结果

2.1 芍药苷缓解CIA 小鼠临床症状 两组小鼠在第24 天开始发病，逐渐出现关节及足趾肿胀和关节活动障碍等症状，至第45 天到达发病高峰。与对照组相比，PF 治疗组小鼠发病程度较轻。第39 天开始治疗组小鼠临床评分与对照组比较具有显著差异(P ＜0.05)，见图1。由此可见，体内给予PF 治疗可明显抑制CIA 发病程度。

图1 芍药苷对CIA 小鼠临床症状的影响Fig.1 Treatment effect of PF on CIA symptoms

2.2 芍药苷减轻CIA 小鼠关节炎症 发病高峰期处死小鼠，取膝关节做石蜡切片，HE 染色，观察关节炎性细胞浸润。光镜下可见:与对照组相比，治疗组炎性细胞浸润明显减少(图2)。

2.3 芍药苷抑制CIA 小鼠脾脏CD4+T 细胞增殖 用3H-TdR 掺入法检测两组小鼠CD3/28 抗体刺激的脾脏单个核细胞和CII 特异性单个核细胞增殖情况，结果显示芍药苷明显抑制脾脏单个核细胞和CII特异性单个核细胞增殖。进一步用3H-TdR 掺入法检测两组小鼠CD3/28 抗体刺激的CD4+T 细胞和CII 特异性CD4+T 细胞增殖情况，结果显示芍药苷明显抑制CD3/28 抗体刺激的CD4+T 细胞和CII 特异性CD4+T 细胞增殖(图3)。相比于CD3/28 抗体刺激，PF 组CII 特异性脾脏单个核细胞增殖和CII 特异性CD4+T 细胞增殖抑制更为明显，提示PF可通过抑制脾脏CII 特异性CD4+T 细胞的增殖，缓解CIA。

图2 芍药苷对CIA 小鼠膝关节组织病理学影响(×200)Fig.2 Histopathology of knee joints from PBS and PFtreated CIA mice by H＆E staining (×200)

图3 芍药苷对CIA 小鼠脾脏细胞增殖能力的影响Fig.3 Effect of PF on proliferation of splenocytes from CIA mice

2.4 芍药苷降低CIA 小鼠Th1 和Th17 细胞亚群比例 CD4+T 细胞在不同细胞因子作用下分别分化为Th1、Th2、Th17、Treg 等细胞亚群，其中Th1 和Th17 细胞在RA 发病过程中起重要作用［6］。用流式细胞技术检测两组小鼠脾脏CD4+T 细胞中Th1和Th17 细胞亚群比例。结果显示，治疗组小鼠Th1和Th17 细胞亚群比例都明显低于对照组(图4)，提示芍药苷可能通过降低Th1 和Th17 细胞亚群比例缓解CIA 临床症状。

图4 芍药苷对CIA 小鼠Th1 和Th17 亚群比例的影响Fig.4 Effect of PF on Th1 and Th17 subsets in spleens from CIA mice

图5 芍药苷对CIA 小鼠脾脏细胞培养上清中炎性细胞因子的影响Fig.5 Effect of PF on cytokine secretion of splenocytes from CIA mice

2.5 芍药苷减少CIA 小鼠脾脏细胞培养上清中炎性细胞因子分泌 ELISA 法检测CIA 小鼠脾脏细胞培养上清中细胞因子IL-17 和IFN-γ 的表达水平。结果显示:与对照组相比，治疗组脾脏细胞培养上清中IL-17 和IFN-γ 含量显著降低(图5)，提示PF 通过减少CII 特异性脾脏细胞分泌炎性细胞因子从而缓解CIA 症状。

3 讨论

RA 是一种以关节病变为特征的系统性、炎性自身免疫性疾病，其主要病理表现是:滑膜细胞过度增生、微血管新生和血管翳形成，分泌炎性细胞因子、核因子κB 受体活化因子配体(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand，RANKL)和抗瓜氨酸蛋白抗体(Antibodies to citrullinated proteins，ACPA)，造成滑膜、软骨和骨组织的破坏，最终导致关节畸形影响功能［7］。CIA 是由Ⅱ型胶原和完全弗氏佐剂(CFA)免疫基因易感型小鼠建立的RA 模型，它与RA 有相似的病理学特征:滑膜纤维细胞增生;单核细胞浸润，软骨降解;体内可以检测到高滴度的Ⅱ型胶原抗体;炎症后期骨破坏，并导致不可逆的关节畸变［8］。由于大多数RA 病人外周血单个核细胞中都伴有CD4+T 细胞活化［9］，提示以CD4+T 细胞为靶点治疗能控制CIA 炎症反应。

TGP 在临床上已用于治疗风湿免疫性疾病，其治疗RA 的主要作用机制包括:止疼镇静、抗炎抑炎、抑制滑膜增生和血管翳形成、保护关节［5］。作为TGP 中的主要单体活性成分，PF 因其易溶于水、吸收好、易于剂量标准化等特点，具有潜在开发价值［10］。目前已有文献证实灌胃给予PF 及其相关药物剂型具有缓解大鼠关节炎的作用［11］，但其在细胞因子及免疫细胞调节方面的作用尚无研究。

本研究表明体内注射芍药苷后CIA 小鼠临床症状明显缓解。进一步检测CIA 小鼠脾脏细胞和CD4+T 细胞增殖情况，发现治疗组小鼠脾脏CII 特异性CD4+T 细胞增殖明显降低，提示芍药苷能直接抑制CD4+T 细胞增殖。已有文献证实，CD4 缺陷性小鼠CIA 发病率更低［12］，同样提示CD4+T 细胞在CIA 发病过程中的重要性。活化的CD4+T 细胞可以分化为不同细胞亚群，其中Th1 和Th17 在CIA病理过程中发挥重要作用。与大多数MHCⅡ基因易感性自身免疫性疾病一样，CIA 小鼠CII 特异性的CD4+T 细胞中Th1 和Th17 细胞亚群比例增高［6，13］。而本研究结果显示，芍药苷治疗后CIA 小鼠脾脏细胞中Th1 和Th17 细胞比例明显降低，提示芍药苷可能通过抑制致病性Th1 和Th17 细胞亚群缓解CIA 病情。IFN-γ 是Th1 细胞分泌的特征性细胞因子，目前根据环境不同其在CIA 病理过程中起着双向作用，现认为在疾病起始阶段体内细胞因子表达较低时，IFN-γ 起致炎作用，但在疾病晚期，当细胞因子表达达到饱和状态时，IFN-γ 起抑炎作用［14］。IL-17 是Th17 分泌的特征性促炎细胞因子，它可以通过激活T 细胞、巨噬细胞介导RA 病理反应［15］，在CII 特异性T 细胞反应起始阶段和CII 特异性抗体分泌阶段扮演重要角色［16］。已有文献证实，IL-17 基因敲除小鼠建立CIA 模型，其发病明显减轻［17］，说明在CIA 病理过程中IL-17 发挥重要作用。芍药苷治疗后发病高峰期CIA 小鼠脾脏细胞培养上清中IFN-γ 和IL-17 分泌含量降低，提示其可通过减少炎性细胞因子分泌而缓解CIA。

综上所述，目前研究结果提示芍药苷可以通过作用于CD4+T 细胞，降低炎性T 细胞亚群比例和减少炎性细胞因子分泌而缓解CIA 病情。这为芍药苷的药物开发提供了实验依据，也为进一步机制研究奠定实验基础。

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