白细胞介素2和白细胞介素6对肝癌细胞表达血管内皮生长因子B的调节

田贵金，唐瑞峰，孙 超，苑建磊，齐 帅，李智峰

(1.河北医科大学第四医院肝胆外科，河北 石家庄 050011；2.河北省邯郸市第一医院普外三科，河北 邯郸 056002)

原发性肝癌恶性度高，预后差是因为肿瘤具有强大的生长和转移能力，而癌细胞的浸润和远处转移与血管内皮生长因子B(vascular endothelial growth factor B，VEGF-B)密切相关。其通过诱导肿瘤周围血管新生，促进癌细胞血行转移。VEGF-B的表达受多种细胞因子的调节，其中细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)2、6可以通过影响细胞活动力、肿瘤细胞的增殖、肿瘤特异性抗原的表达从而影响肿瘤的进展，也可以通过调节VEGF-B的表达来影响肿瘤的生物学特性。本研究分析IL-2及IL-6对人肝癌细胞表达VEGF- B的调节，旨在为肝癌的治疗提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 细胞培养、刺激及总RNA的提取：在37℃、5%CO2的饱和湿度的无菌培养箱中应用RPMI 1640培养基(含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100U/mL链霉素)培养人肝癌细胞株SMMC-7721及BEL-7402。细胞呈稳定对数生长后，更换浓度为0.1%胎牛血清RPMI 1640培养基继续培养12h，以消除血清对细胞增殖的影响。然后分别应用含有0.1、1、10、100、200μg/L的IL-2或IL-6的0.1%胎牛血清的培养基作为实验组，分别培养3、6、12、24h，对照组中加入等剂量的磷酸钠盐缓冲液培养，定时收取细胞后以Trizol一步法提取刺激前后总RNA。

1.2 RT-PCR：取总RNA 2μL，加入AMV逆转录酶及逆转录反应物，42℃、反应60min；取所得单链cDNA 2μL，加入VEGF-B正义引物2.5μ、反义引物2.5μL、PCR反应物13μL，使总反应体系为20μL，94℃、3min预变性，95℃、45s变性，57℃、45s退火，72℃、1min延伸，共扩增35个循环后72℃、5min再次延伸。同法，取所得cDNA 2μL，加入GAPDH正义引物2.5μL、反义引物2.5μL、PCR反应物13μL，使总反应体系为20μL，预变性条件95℃、3min，变性条件94℃、30s，57℃、30s退火，72℃、 30s延伸，共扩增35个循环后72℃再次延伸5min。扩增循环数由PCR扩增动力学实验决定。各PCR总产物在普通琼脂糖凝胶(1.5%)电泳，运用溴化乙啶染色，所得DNA电泳条带和光量子强度以凝胶扫描仪进行检测分析，以GAPDH作为内参照，并将VEGF-B/GAPDH比值作为相对定量值对VEGF-B产物相对定量。VEGF-B正义引物，5′TGTCCCTGGAAGAACACAGCC3′，反义引物，5′GCCATGTGTCACCTTCGCA 3′，它对应生成1个336个碱基的基因片段。GAPDH正义引物，5′GGGAAACTGTGGCGTGAT3′，反义引物，5′GTGGTCGTTGAGGGCAAT3′，它对应生成1个342个碱基的基因片段。

2 结 果

在0.1～200μg/L范围内，随浓度的增加，IL-2抑制肝癌细胞株SMMC-7721 VEGF-B mRNA表达的作用逐步增强，但与作用时间无明显关系(图1)。

图1 IL-2对肝癌细胞SMMC-7721表达VEGF-B mRNA的影响

Figure 1 Expression of VEGF-B mRNA in SMMC-7721 cell line stimulated by IL-2

随浓度的增加，IL-2抑制肝癌细胞株BEL-7402 VEGF-B mRNA表达的作用逐步增强，3h 0.1μg/L与1μg/L实验组之间VEGF-B mRNA的表达差异无统计学意义(P=0.488)，12h 0.1μg/L与1μg/L实验组之间VEGF-B mRNA的表达差异无统计学意义(P=0.074)；但与作用时间无明显关系(图2)。

图2 IL-2对肝癌细胞BEL-7402表达VEGF-B mRNA的影响

Figure 2 Expression of VEGF-B mRNA in BEL-7402 cell line stimulated by IL-2

随浓度的增加，IL-6促进肝癌细胞株SMMC-7721 VEGF-B mRNA表达的作用逐渐减弱，但与作用时间无明显关系(图3)。

图3 IL-6对肝癌细胞SMMC-7721表达VEGF-B mRNA的影响

Figure 3 Expression of VEGF-B mRNA in SMMC-7721 cell line stimulated by IL-6

IL-6对肝癌细胞株BEL-7402 表达VEGF-B mRNA无明显影响(图4)。

图4 IL-6对肝癌细胞BEL-7402表达VEGF-B mRNA的影响

Figure 4 Expression of VEGF-B mRNA in BEL-7402 cell line stimulated by IL-6

3 讨 论

原发性肝癌(简称肝癌)是我国病死率很高的恶性肿瘤，早期诊断率低，病情进展快，预后差[1]。早期血行转移是导致肝癌预后差的主要原因之一，而肿瘤的生长和转移有赖于血管新生，血管内皮生长因子家族(vascular endothelial growth factor family,VEGFs)是促进血管新生的关键因子之一，VEGFs包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E和胎盘生长因子(placenta growth factor，PIGF)，我们的前期研究显示VEGF-B及其受体Flt-1在肝癌组织中的表达水平显著高于癌旁肝组织和正常肝组织，且二者在肝癌中的表达呈显著正相关，二者相互作用促进肝癌血管生成，进而促进肝癌的浸润和转移[2]。

在恶性肿瘤的进展中某些细胞因子起重要作用[3-4]。这些细胞因子是癌细胞与基质细胞间相互作用的主要介质，而癌细胞与基质细胞间相互作用是癌细胞浸润周围组织、形成淋巴和远处脏器转移的关键。IL-1和IL-6可促进VEGF的表达，促进新生血管的形成[5]；IL-1α和IL-6可刺激胰腺癌细胞产生VEGF-A和VEGF-C，是胰腺癌细胞合成和分泌VEGF-A、VEGF-C的调节因子[6]；IL-2通过抑制胰腺癌细胞产生VEGF-D而抑制胰腺癌淋巴转移[7]；Salven等[8]报道了IL-1α通过诱导炎症细胞合成和分泌VEGF-A促进血管新生；Huang等[9]证实了IL-6刺激胃癌VEGF-A的产生并使癌组织中新生血管增加。

IL-2是一种重要细胞因子，IL-2不仅能通过激活免疫系统杀伤肿瘤细胞，同时能抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡[10-11]。本研究表明，IL-2对2种肝癌细胞株SMMC-7721及BEL-7402产生VEGF-B mRNA均有抑制作用。提示IL-2通过抑制肝癌细胞产生VEGF-B而抑制肝癌的血行转移。

IL-6在免疫应答及炎症反应中起重要作用，它可以通过细胞因子网络影响宿主环境进而作用于肿瘤细胞，对肿瘤细胞有抑制和促进的双重作用。多种疾病可能都与IL-6基因调节异常有关[12]。当IL-6及其受体平衡失调时，会影响机体内环境的稳定，进而导致免疫功能紊乱，诱导肿瘤的发生发展。本研究显示IL-6刺激肝癌细胞株SMMC-7721产生VEGF- B明显增加，从而可能使肝癌细胞更易发生血行转移，是肝癌难以早期发现和预后较差的原因之一。肝炎后肝硬化基础上发生的肝癌，癌细胞周围的微环境中因炎性反应致IL-6呈持续高水平表达，刺激癌细胞产生VEGF-B增加，使癌细胞更易发生肝内等血行转移，这可能是肝炎后肝硬化基础上发生的肝癌其预后较无肝炎肝硬化背景的肝癌的预后差的原因之一，也可能是临床上抗病毒加抗癌“双管齐下”较单纯抗癌治疗效果更好的原因之一。但IL-6对肝癌细胞的作用可能是一把“双刃剑”，其作用随剂量、机体微环境的变化而不同，仍需进一步研究。

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