顺式二苯乙烯苷的制备及结构鉴定

董立华，郭盼盼，郭 栋，闫文英，王春英*

(1.河北医科大学药学院药物分析教研室，河北 石家庄 050017；2.华北制药集团公司新药研究开发中心，河北 石家庄 050010)

苯乙烯苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，THSG)为蓼科植物何首乌中的主要成分，它具有抗氧化、降血脂、抑制骨质疏松[1]、抑制血管内皮细胞过度增生[2]、神经保护[3]、心肌保护[4]、改善动脉硬化及加速血流[5]等作用。从结构上看，THSG存在顺反异构体，在自然条件下主要以反式二苯乙烯苷(trans-2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，trans-THSG)存在，有实验[6]表明在光照的诱导下反式结构可以转化成顺式二苯乙烯苷(cis-2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glucoside，cis-THSG)。许多药物因为异构体的存在而显示出不同的药理活性，然而以往对何首乌中二苯乙烯苷的探索都是以trans-THSG为研究对象而忽视了cis-THSG的存在。为了进一步对cis-THSG进行体内外的深入研究，首先要获得足够量的cis-THSG及其纯品。由于cis-THSG没有市售的对照品，且何首乌药材中cis-THSG的含量很少，通过分离提取也很难获得。本研究旨在通过优化光催化作用的条件，使trans-THSG转变成cis-THSG，采用制备液相技术[7]获得cis-THSG的纯品(≥98.0%)，并以四大光谱联用进行结构鉴定。

1 仪器与试药

3200 QTRAP 型串联四级杆线性离子阱质谱仪，配有Turbo V离子源(美国AB公司)，紫外分光光度计TU-1901(北京普析通用仪器有限责任公司)，磁共振仪(美国Bruker公司)，红外分光光度计FTIR-8400S(日本岛津)，高效液相色谱仪(美国Agilent 1200，二极管阵列检测器)，紫外灯250 W-L 130 mm(北京中瑞达电光源厂)，LG16-B型离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)，冷冻干燥机(德国Christ公司)。

trans-THSG对照品(中国食品药品检定研究院，批号0844-1005)，trans-THSG(本研究室从何首乌中分离提取，经测定纯度为98.5%)，色谱甲醇(J.T.-Baker)，纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件：色谱柱 Diamonsil C18柱(分析250mm×4.6mm,5μm；制备250mm×10.0mm,5μm；预柱7.6mm×4.6mm，5μm)；流动相甲醇(A)-水(B)，梯度程序如下，0～1min、5%～30% A，1～10min、30%～72% A，10～11min、72%～95% A，11～14min、保持95% A；每次进样前先以5% A预平衡10min；检测波长285nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；分析进样量20μL，制备进样量100μL。结构图见图1，色谱图见图2。

图1 trans-THSG和cis-THSG的化学结构

图2 高效液相色谱图

2.2 转化条件的考察

2.2.1 光照条件的选择：精密称定trans-THSG适量于量瓶中，用水溶解并稀释成浓度为0.1g/L的溶液。分别精密量取9份相同体积的溶液于大小形状都相同的小烧杯中，各取3份分别在日光、254nm紫外光和365nm紫外光下照射，20min后取出放冷，用水补足失重，摇匀，以14 000r/min离心10min，取上清液分别注入液相色谱仪进行测定。根据各组cis-THSG的峰面积平均值进行分析，结果表明，trans-THSG在254nm紫外灯下照射几乎没有转化，在日光下照射转化率较少，而在365nm紫外灯下照射时的转化率最大，因此选择365nm紫外光照射。

2.2.2 溶剂的选择：分别用水和甲醇为溶剂配制浓度为0.1g/L的trans-THSG溶液，在365nm紫外灯下照射20min，取出放冷后分别用水和甲醇补足减失的质量，摇匀，以14 000r/min离心10min，取上清液，用水稀释后分别注入液相色谱仪进行测定，根据cis-THSG的峰面积进行统计分析。结果表明，溶剂为水和甲醇时，其峰面积差异无统计学意义。由于甲醇毒性比较大，且甲醇为溶剂进行色谱分离时存在较强的溶剂效应，因此我们最终选择了以水作溶剂进行转化。

2.2.3 初始浓度及光照时间的选择：配制trans-THSG的系列浓度水溶液，0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0g/L，每个浓度6份，分别在365nm紫外灯下照射5、10、15、20、25、30min，取出放冷，用水补足失重，摇匀，按trans-THSG的初始浓度计，各溶液稀释至相同浓度，以14 000r/min离心10min，取上清液注入高效液相色谱仪进行测定，记录cis-THSG的峰面积，间接评价转化率的高低。结果表明，低浓度时随着光照时间的延长，转化率越来越低(图3A)，而高浓度时随着光照时间的延长，转化率越来越高(图3B)。为了比较各溶液中cis-THSG的浓度高低，我们用峰面积乘以稀释倍数作为各转化后溶液的表观峰面积(图4)。通过对图3，4综合分析，初始浓度为6.0g/L，照射时间为20min时，具有较高的转化率和制备效率。

2.3 cis-THSG的制备：称取trans-THSG，用水溶解成浓度为6.0g/L的溶液，在365nm紫外灯下照射20min，以14 000r/min离心10min，取上清液注入液相色谱仪进行分离制备。分别收集cis-THSG和trans-THSG的流分，前者经50℃减压蒸馏，剩余物用水溶解后冷冻干燥得白色固体粉末(cis-THSG)。避光密封保存于-20℃冰箱中备用。后者按相同方法回收后，重复上述方法进行转化，分离。

2.4 结构鉴定：质谱条件，源喷射电压-4 500V，气帘气1.03×105Pa，雾化气1.03×105Pa，解簇电压 (DP)-38V(trans-THSG和cis-THSG)，碰撞电压 (CE) -48 eV (trans-THSG和cis-THSG)。分别取trans-THSG和cis-THSG适量，50%甲醇溶解，针泵进样，分别得到一级、二级质谱图(图5)，由图中可知，cis-THSG与trans-THSG具有相同的准分子离子m/z 405.1[M-H]，表明二者具有相同的分子量。对准分子离子m/z 405.1[M-H]进行二级质谱扫描，得到相同的丢失一个糖基的碎片离子m/z 243.1[M-C6H11O5]及其他相同的碎片离子，如m/z 225.1、173.0、145.2、137.1和109.0，表明二者具有相同的裂解规律。

图3 初始浓度及光照时间对转化率的影响

A.低浓度；B.高浓度

Figure 3 Effect of incipient concentration and illumination time on conversion

A.Low concentration;B.High concentration

图4 各浓度下表观峰面积随时间的变化

Figure 4 Changes in the concept of apparent peak area of each concentration with time

图5 质谱图

A.trans-THSG一级质谱图；B.cis-THSG一级质谱图；C.trans-THSG二级质谱图；D.cis-THSG二级质谱图

Figure 5 Mass spectra

A.First order mass spectrum of trans-THSG;B.First order mass spectrum of cis-THSG;C.Second order mass spectrum of trans-THSG;C.Second order mass spectrum of cis-THSG

核磁共振数据及归属如下：1H-NMR[500 MHz,CD3OD]δ，3.20(m,1H,C2″-H),3.38 (dd,J=9.0 Hz,1H,C5″-H),3.45 (t,J=9.0 Hz,1H,C4″-H),3.48 (t,J=9.0Hz,1H,C3″-H),3.69-3.79(m,2H,C6″-H),4.57 (d,J=8.0Hz,1H,C1″-H),6.14 (d,J=3.0Hz,1H,C4-H),6.23(d,J=3.0Hz,1H,C6-H),6.48 (d,J=12.0 Hz,1H,β-H),6.61(d,J=8.5Hz,2H,C3′,5′-H),6.72 (d,J=12.0Hz,1H,α-H),7.06 (d,J=8.5 Hz,2H,C2′,6′-H)。其中δ 6.48(d,1H) 和6.72(d,1H) 的耦合常数为12.0Hz，与反式耦合常数16.5 Hz不同，可以说明这两个不饱和碳上的质子信号为顺式双键质子信号。

13C-NMR[125MHz,CD3OD]δ：62.2 (C6″),71.0 (C4″),75.4(C2″),77.9(C3″),78.3(C5″),103.7 (C1″),107.6(C4),108.2(C6),115.9(C3′,C5′),125.5(C1),129.8 (Cα),131.3(C1′),131.4 (C2′,C6′),133.9(Cβ),137.8(C2),151.8(C5),155.3(C3),157.7(C4′)。

紫外全扫描图谱结果显示其最大吸收波长由trans-THSG的320nm移至285nm处(图6)，与文献报道一致[8]。

图6 紫外扫描光谱 (50mg/L水溶液)

A.trans-THSG;B.cis-THSG

Figure 6 UV scanning spectra (50mg/L aqueous solution)

A.trans-THSG;B.cis-THSG

红外光谱数据(KBr,cm-1):3 500和3 200 (νO-H)，2 924和2 885 (νC-H)，1 609和1 514(νC-C)，1 456(δC-H)，690 (γ=C-H) 其中690cm-1为顺式烯烃面外振动的标志，而反式烯烃的面外振动在970cm-1。

根据上述四大光谱解析，可知制备得到的化合物即为目标化合物cis-THSG。

3 讨 论

3.1 转化条件的总体分析：本研究结果表明，低浓度时随着光照时间的延长，trans-THSG转化为cis-THSG的转化率越来越低，而高浓度时随着光照时间的延长，转化率越来越高；而各溶液中trans-THSG的量均随时间呈下降趋势。其原因可能与苷类化合物降解有关，且符合浓度越小越容易发生降解的普遍规律。虽然在色谱图中观察不到明显的降解物峰，但是很可能会影响目标物峰的纯度，转化时间也不易过长。因此在保证一定的转化率和制备效率的同时，转化时间越短越好。

3.2 展望：天然存在于何首乌中的二苯乙烯苷大多为反式结构，顺式含量仅有5.985%，本研究结果表明其在光照条件下可发生顺反异构而转化为顺式结构，今后应对cis-THSG的生物活性、毒性等加以研究，以期更合理地评价光致异构对二苯乙烯苷用药有效性和安全性的影响。

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