锰-超氧化物歧化酶、过氧化氢酶在异丙肾上腺素所致大鼠心肌肥厚中的表达

朱玉林，米立国，郝连军，杜建文，王瑞芬

(1.河北省邯郸市妇幼保健院麻醉科，河北 邯郸 056001；2.河北医科大学基础医学院人体解剖学教研室，河北 石家庄 050017；3.河北省血液中心检验科，河北 石家庄 050071；4.河北省承德市中心医院超声诊断科，河北 承德 067000；5.河北省沧州市中心医院儿科，河北 沧州 061000)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是心脏对慢性压力或容量超负荷等因素所作出的一种代偿性反应[1-2]。大量研究[3]表明氧化应激可能是导致心肌肥厚的重要原因。在心肌肥厚的形成和发展过程中，活性氧族(reactive oxygen species，ROS)产生增多[4]。过多的ROS如不被机体及时清除，就会损害心肌细胞内的蛋白质和脂类等生物大分子引起细胞死亡[5]。锰-超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutases，Mn-SOD)主要负责清除线粒体内的超氧阴离子[6-7]；过氧化氢酶(catalases，CAT)主要负责清除细胞内的过氧化氢[8-9]。CAT与Mn-SOD是维持心肌正常功能所必需的抗氧化酶。以前的研究只观察了Mn-SOD 和CAT在心肌肥厚模型中蛋白活性的改变，均未对这两个重要抗氧化酶系基因水平的表达变化进行观察。

1 材料与方法

1.1 实验动物和取材：健康雄性SD大鼠16只，体质量(300±10)g，随机分为对照组(Control组)和心肌肥厚模型组(Iso 组)。参照Borges等[10]的方法,Iso组大鼠通过背部皮下注射异丙肾上腺素(5mg·kg-1·d-1),连续注射7 d制备大鼠心肌肥厚模型；对照组大鼠背部皮下只注射等体积的生理盐水。两组大鼠均自由进食进水。末次给药24h后称量大鼠体质量(body weight,BW),6%水合氯醛(5mL/kg体质量)腹腔注射麻醉。分离右侧颈总动脉插入自制聚乙烯导管，稳定后记录右颈总收缩压(systolic blood pressure,SBP)、舒张压(diastolic blood pressure,DBP),计算平均动脉压(mean aterial pressure,MAP)；收集大鼠血液，3 000r/min离心10min,分离血清，用于血清乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase，LDH) 活性测定；开胸取心称量左心及全心质量、测量左心室壁厚度。此外，将一部分心脏标本放入液氮中用于总RNA的提取；另一部分放入固定液内固定，用于光镜和透射电镜观察。

1.2 主要试剂：LDH测定试剂盒为中生北控生物科技公司产品，TRIzol、RT试剂盒、Taq DNA聚合酶均为Invitrogen公司产品。

1.3 血压测量：麻醉后固定大鼠，分离右侧颈总动脉，插入和压力换能器相连的自制聚乙烯导管，稳定后记录右颈总动脉SBP、DBP，计算MAP=(SBP+DBP×2)/3。

1.4 LDH活性测定:LDH活性按照试剂盒的操作说明采用乳酸脱氢酶-乳酸(lactate dehydrogenase-lactate,LD-L)速率法测定。

1.5 测量心质量及左心室壁厚度:大鼠麻醉后开胸取心，用镊子轻压心体挤出内部残留血液并用冷生理盐水洗掉表面血液，滤纸拭干后迅速置于电子天平内称量全心质量(heart weight,HW)，再迅速分离左心室称量质量(left ventricle of heart weight,LHW)，计算心质量指数(HW /BW，LHW/BW)。打开左心室分离室间隔(interventricular septum，VST)与游离心室壁(left ventricular wall thickness,LVWT)，用游标卡尺测量其厚度。

1.6 心肌的光镜和透射电镜观察： 按照光镜与透射电镜的要求进行样品制备，分别于光镜与透射电镜下观察心肌纤维形态变化,并进行图像分析。

1.7 Mn-SOD、CAT的mRNA测定：用TRIzol法提取心肌总RNA。以GAPDH为内参照，进行RT-PCR。分别以Mn-SOD、CAT和GAPDH的扩增产物的灰度值之比表示其mRNA的相对表达量。GAPDH引物，上游，5′GCTGAGTATGTCGTGGAGT 3′，下游，5′TCTTCTGAGTGGCAGTGAT 3′；Mn-SOD引物，上游，5′TGACCTGCCTTACGACTA 3′，下游，5′CGACCTTGCTCCTTATTG 3′；CAT引物，上游，5′TATTGCCGTCCGATTCTC 3′，下游，5′ATGCCCTGG-TCAGTCTTG3′。

2 结 果

2.1 血压：与对照组相比，Iso 组大鼠血压明显升高(P<0.01)，见表1。

2.2 LDH活性：与对照组相比，Iso 组大鼠血清LDH活性明显升高(P<0.01)，见表1。

2.3 HW /BW与LHW/BW的改变：与对照组相比，Iso 组大鼠的HW/BW与LHW/BW均明显增加(P<0.01)，见表1。

2.4 VST与LVWT的改变：与对照组相比，Iso组大鼠的VST与LVWT均明显增加(P<0.01)，见表1。

2.5 心肌组织的光镜观察：Iso组大鼠心肌组织的HE染色切片在光镜下可见大片纤维化区域，成纤维细胞多，偶可见单核细胞，局部区域毛细血管扩张，心肌细胞排列不连续，胞浆变宽,胞核变大,呈现明显的心肌肥厚纤维化表现(图1)。对照组大鼠的心肌纤维排列整齐，心肌细胞胞核清晰，无胶原纤维增生(图2)。

2.6 心肌组织的透射电镜观察：对照组大鼠心肌纤维明带、暗带结构清晰，肌节长度适中，肌纤维排列整齐，线粒体数量结构未见异常(图3)。心肌肥厚模型组大鼠线粒体数量较多，线粒体嵴增多密集，线粒体肿胀，个别线粒体出现空泡样变，心肌纤维内肌丝有溶解现象，心肌纤维间隙增宽、成纤维细胞明显，间隙内出现凋亡细胞(图4～6)。

2.7 Mn-SOD、CAT的 mRNA表达变化：与对照组相比，Iso组大鼠心肌组织内Mn-SOD、CAT的mRNA表达水平均明显增强(P<0.05)，见表2。

GroupsMAP(kPa)LDH (U/L)HW/BW(mg/g)LHW/BW(mg/g)LVWT(mm)VST(mm)Control10.21±0.81514.83±13.433.05±0.232.33±0.113.56±0.182.44±0.07Iso14.05±1.19∗876.66±9.52∗4.51±0.39∗3.26±0.25∗4.33±0.31∗3.11±0.19∗

*P<0.01vscontrol group byttest

MAP:mean arterial pressure;LDH:lactate dehydrogenase;HW/BW:heart weight/body weight;LHW/BW:left ventricle of heart weight/body weight;LVWT：left ventricular wall thickness;VST:interventricular septum;Iso:isoproterenol

GroupsMn-SODCATControl0.625±0.0950.763±0.129Iso0.998±0.154∗1.051±0.143∗

*P<0.05vscontrol group byttest

Mn-SOD:manganese superoxide dismutases;CAT:catalases;Iso:isoproterenol

3 讨 论

心肌肥厚是多种心血管疾病所具有的共同病理过程，如不及时治疗会发展成心功能衰竭。因此，对心肌肥厚发病机制的探讨一直是心血管研究的重点之一。到目前为止，对于其发病机制的研究主要是通过动物模型来实现的。Iso是一种β受体激动剂，可增强心肌收缩力，加快心率，使心肌耗氧量明显增加，并能促进心肌细胞总蛋白和非收缩蛋白合成,使心肌细胞肥大，胶原纤维增生，导致心肌肥厚的形成[11-12]。本研究结果显示，在给大鼠注射7d Iso后，HE和电镜结果均提示大鼠出现心肌肥厚的病理改变；同时，Iso组大鼠的血压升高，HW/BW、LHW/BW、LVWT、VST等均明显增加，进一步证实心肌肥厚的发生；此外，血清内LDH活性明显升高，说明此时心肌细胞已严重受损，导致释放入血的LDH增多，活性升高。以上这些结果均表明使用Iso诱导的心肌肥厚模型是成立的。

在心肌肥厚的发生发展过程中，心肌细胞消耗的能量明显增强。机体通过加强线粒体氧化磷酸化来增加三磷酸腺苷的合成，满足心肌过多的能量消耗。但在这个过程中从电子传递链泄漏的ROS也会随之增多。它们可以使生物膜内的多不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应,改变生物膜的结构和功能。此外，ROS还可损伤线粒体的结构和功能,使三磷酸腺苷合成减少,加重心肌能量缺乏,进一步促进心肌肥厚的发生发展。这可能是我们建立的大鼠心肌肥厚模型出现明显的心肌细胞受损、心肌肥厚纤维化等病理改变的直接原因。同时，Mn-SOD和CAT的mRNA表达水平在心肌肥厚模型组大鼠明显增强。推测：当心肌肥厚等病理改变发生后，心肌组织内ROS的产生量明显增多，此时机体通过上调Mn-SOD、CAT的基因表达水平，增加其生成量来清除过多的ROS，保护心肌细胞免遭损伤，防止心肌肥厚的进一步发展。本研究结果进一步证实了SOD和CAT 2个抗氧化酶在心血管疾病防治中的重要作用，这将为心肌肥厚防治方法的研究提供一定的理论参考。(本文图见封二)

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