高效液相色谱法测定左乙拉西坦血药浓度

周春华，张志清* ，何文娟，李敬瑄，吴亚敏

(1.河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000；2.河北医科大学基础医学院药理学教研室，河北 石家庄 050017)

左乙拉西坦(levetiracetam)是吡拉西坦衍生物中的左旋乙基吡拉西坦，其化学名称为(S)-α-乙基-2-氧代-1-吡咯烷乙酰胺，分子式为C18H14N2O2[1-2]。左乙拉西坦是一种新型的抗癫痫药，其结构和抗癫痫的机制与其他药物不同，主要是选择性地抑制癫痫样突发放电的超同步性和癫痫发作的传播而发挥作用，2007年引入中国，用于治疗癫痫的部分发作、原发性或继发性全身发作[3-5]。左乙拉西坦口服几乎可以完全吸收，进食可减慢其吸收速度，但不影响其吸收程度[6]。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂：左乙拉西坦对照品(珠海联邦制药股份有限公司，纯度>99%，批号404809001)，替硝唑对照品(中国食品药品检定研究院，纯度>99%，批号100336-200402)，磷酸(分析纯，石家庄化工厂，批号19981116)，乙腈(色谱纯天津市康科德科技有限公司，批号101203)，乙酸乙酯(分析纯，天津市北辰马华跃化学试剂厂，批号20050718)，蒸馏水(河北医科大学第二医院自制)。

1.2 仪器：高效液相色谱仪，Waters 515泵，486色谱检测器，操作平台Empower Application；电子天平(FA2104，上海良平精密仪器厂)；冰箱(日本三洋，型号MDF-U2086S)；离心机(北京医用离心机厂，LD5-10)；涡旋混合器(上海医科大学仪器厂，XW-80A)；数控恒温水浴(北京康林科技有限责任公司，氮吹仪专用，KL512J)；抽滤泵(天津市协同仪器有限公司)；超声机(昆山市超声仪器有限公司)。

1.3 色谱条件：色谱柱，Diamonsil C18(250×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈∶0.4%磷酸溶液=20∶80(V/V)；检测波长210nm；柱温35℃；进样量20μL[7]；流速1.0mL/min；内标为替硝唑。

2 方法与结果

2.1 模拟生物样品处理方法：取血清180μL于10mL塑料离心管中，加左乙拉西坦(系列浓度)20μL和内标(200mg/L)50μL，混匀，加乙酸乙酯3mL，涡旋，离心，取2.5mL上清液于5mL玻璃离心管中，50℃水浴，氮气流吹干，100μL甲醇复溶，进样。

2.2 溶液的配制：储备液的制备，精密称取左乙拉西坦50mg，溶于50mL量瓶中，用甲醇溶解定容，得1g/L的左乙拉西坦溶液作为母液。

标准溶液的制备，取储备液适量于25mL的量瓶中，分别用甲醇稀释成10、25、50、200、400、800mg/L的标准溶液；再取800mg/L的标准溶液适量于25mL的量瓶中，甲醇稀释成100mg/L的标准溶液。

内标溶液的制备，精密称取替硝唑对照品约20mg置100mL量瓶中，甲醇稀释定容，得200mg/L的内标溶液。

2.3 专属性考察：在选定的色谱条件下，内标与药物完全分离，药物保留时间为4.3min，内标保留时间为8.4min，出峰时间均在10min之内，且血清中的内源性物质对其无干扰，见图1。

2.4 标准曲线的制备：取血清常温融化，精密吸取180μL于10mL塑料离心管中,加系列浓度的左乙拉西坦溶液20μL，加内标50μL，配成血清中左乙拉西坦浓度依次为1、2.5、5、10、20、40、80mg/L的标准溶液，依次加入提取剂(乙酸乙酯)3mL，涡旋混合2min，4 000r/min离心5min，取上清液2.5mL于5mL

玻璃离心管中，50℃水浴，氮气流吹干，100μL甲醇复溶，进样。以药物和内标的峰面积比值对药物浓度进行线性回归得线性回归方程Y=0.096 4X+0.017 2(r=0.999 1)，线性范围1～80mg/L。

图1 高效液相色谱图

A.空白血清；B.血清模拟样品；C.给药后血清样品；1.左乙拉西坦；2.内标

Figure 1 HPLC chromatograms

A.Blank serum;B.Blank serum with levetiracetam and tinidazole;C.Serum sample;1.Levetiracetam;2.Tinidazole

2.5 回收率

2.5.1 提取回收率：配制左乙拉西坦血清浓度分别为2.5、10、40mg/L的模拟血清生物样品，并按“2.1”项下处理方法处理，进样，测定药物峰面积S血药。另取浓度分别为2.5、10、40mg/L的标准溶液，吹干，100μL甲醇复溶后直接进样测定药物峰面积S纯药。取180μL血清加100mg/L的内标溶液50μL，其余按血清生物样品处理方法处理，测定峰面积S血清内标。另取浓度为100mg/L的内标溶液，吹干，100μL甲醇复溶后进样测定峰面积S纯内标。左乙拉西坦与内标的提取回收率。见表1。

2.5.2 方法回收率：配制左乙拉西坦血清浓度分别为2.5、10、40mg/L的血清模拟生物样品各5份，并按“2.1”项下处理方法处理，测得峰面积比值，并根据标准曲线得到浓度，利用该浓度与加入浓度的比值计算方法回收率。见表1。

2.6 精密度：配制高、中、低浓度分别为2.5、10、40mg/L的模拟血清样品，均按“2.1”处理方法处理，日内连续测定高、中、低各5组的峰面积，得到峰面积比值，根据标准曲线计算日内精密度；日间连续5d测定高、中、低3个浓度的模拟生物样品，根据标准曲线计算日间精密度。见表1。

表1 回收率及精密度试验结果Table 1 Results of recovery and precision test (n=5，%)

LEV：levetiracetam；RSD：relative standard deviation

2.7 稳定性考察：取180μL血清于10mL塑料离心管中，加100mg/L的左乙拉西坦溶液20μL，分别考察-40℃冰箱放置5d稳定性、反复冻融3次稳定性和处理样品室温放置4h稳定性。见表2。

表2 稳定性试验结果Table 2 Results of stability test (n=5,%)

LEV：levetiracetam；RSD：relative standard deviation

2.8 临床应用：本法可用于临床患者血清中药物浓度的测定。

3 讨 论

内标选择曾考虑过以拉莫三嗪、奥卡西平，并依次在254、210、220、240nm波长处测定其出峰时间和峰面积，但都由于最大吸收波长与药物最大吸收波长不接近而导致在以上波长条件下吸收过小，并最终选定替硝唑为内标，选用该内标具有杂质干扰少、保留时间适宜等优点。

分离提取时先采用乙酸乙酯和二氯甲烷2种溶剂分别作为提取剂，虽然二氯甲烷[8]提取不易出现乳化，但通过比较两者提取后杂质峰的干扰程度，最终采用乙酸乙酯，采用乙酸乙酯提取使提取率较高而且稳定，各浓度提取率的平均相对偏差均小于10%。

根据查阅的文献[9-10]初步确定选用0.4%磷酸溶液和乙腈的混合溶液为流动相并最终确定乙腈∶0.4%磷酸溶液=20∶80(V/V)作为流动相，该流动相可使血清中的杂质，药物和内标的到很好的分离。

本实验方法中对左乙拉西坦血清样品2.5、10、40mg/L 3个浓度做了日内、日间精密度的测定，分别算出平均值、标准差。由数据可知,左乙拉西坦日内、日间精密度RSD均在规定范围内，因此本实验方法稳定、重现性好，能够用于血药浓度测定。

试验中我们还发现含左乙拉西坦的血清在-40℃低温保存和反复冻融时，血药浓度基本不变。从而保证实验方法的可行性，为今后的研究工作提供了方法和依据。

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[2] 薛娜，周春华，张恺，等.左乙拉西坦的合成[J].河北医科大学学报，2013,34(9):1048-1050.

[3] 刘腾，赵志刚.左乙拉西坦的药理和临床评价[J].中国新药杂志,2007,9(16):733-735.

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[7] 赵润,肖晓芸.左乙拉西坦治疗小儿癫痫研究进展[J].现代医药卫生,2011,23(27):3586-3587.

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