那可丁对人卵巢癌SKOV3细胞增殖和凋亡的影响

申 薇，梁冰锋，秦秀红，秦金金，黄军岩，程建新*

(1.河北医科大学第四医院妇产科，河北 石家庄 050011；2.河北女子职业技术学院护理系，河北 石家庄 050091)

卵巢癌是女性常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌，严重威胁女性健康。目前关于卵巢癌的治疗，除手术外，以紫杉醇、顺铂等为主的联合化疗是主要治疗手段[1]。然而由于化疗药物在血液、神经等方面的不良反应，以及多药耐药性的产生，严重影响了药物的化疗效果和临床疗效。因此，有必要寻找不良反应小的抗肿瘤药物来改善卵巢癌的治疗效果，以提高患者的生存质量[2]。那可丁是一种来自于鸦片的邻苯二甲酸异喹啉生物碱，结构与秋水仙碱相似，一直作为镇咳药使用。那可丁能够与微管蛋白相结合，使微管蛋白的动态性能得以改变，进而延长了肿瘤细胞周期有丝分裂的静止期，达到抗肿瘤活性的作用，可抑制多种恶性肿瘤细胞的生长[3]。本实验采用体外培养的人卵巢癌SKOV3细胞株作为研究对象，检测那可丁对细胞增殖、凋亡及成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor-2,FGF-2)表达的影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和仪器:注射用顺铂购自山东齐鲁制药厂，那可丁、胰蛋白酶、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染液购自美国Sigma公司，磷酸缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)、RPMI l640培养液购自美国Gibco公司，二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)购自天津化学试剂厂，胎牛血清购自杭州四季青公司，四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)购自洛阳华美生物工程公司，FGF-2兔抗人单克隆抗体购自美国Epitomics公司。流式细胞仪，Epics-XLⅡ型，美国Beckman Coulter公司生产；酶标仪，HT2-125500型，郑州博赛生物工程公司生产。

1.1.2 细胞株:人卵巢癌SKOV3细胞株由河北医科大学第四医院科研中心提供。将人卵巢癌SKOV3细胞置于37℃、5%CO2培养箱内，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液在培养瓶内单层传代培养。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测细胞增殖抑制率：取对数生长期的SKOV3细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，调整细胞密度为2.5×104个/mL，接种于96孔培养板中，200μL/孔(含5×103个细胞)，每组设3个平行孔，分为加生理盐水的对照组和那可丁(5、10、20、40、80、160μmol/L)组。细胞培养24、48和72h后，加入MTT(5g/L)20μL/孔，继续培养4h。弃去上清液，加入DMSO(200μL/孔)，振荡10min使结晶充分溶解。用酶标仪测其在490nm波长处的吸光度(optical delnsity，OD)值，按以下公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.2 倒置显微镜观察细胞形态:取对数生长期的SKOV3细胞，分为加生理盐水的对照组和那可丁(10、20、40μmol/L)组，细胞培养48h后，在倒置显微镜下观察细胞的形态学变化。

1.2.3 流式细胞术检测细胞周期及凋亡率:取对数生长期的SKOV3细胞，分为加生理盐水的对照组和那可丁(10、20、40μmol/L)组，培养48h后收集细胞，用无菌冷PBS离心洗涤3次，轻轻振荡后，加70%酒精固定，4℃保存过夜。PBS离心洗涤细胞3次，调整细胞浓度为1×106个/mL，取1mL细胞悬液，加入PI染液，使其终浓度达到50mg/L PI，4℃避光染色30min后上流式细胞仪检测。分别应用Muticycle AV软件和Expo ADC软件对细胞周期的时相分布和细胞凋亡情况进行分析。

1.2.4 流式细胞术检测细胞的蛋白表达：取对数生长期的SKOV3细胞，分为加生理盐水的对照组和那可丁(10、20、40μmol/L)组，培养48h后收集细胞，用无菌冷PBS离心洗涤3次，轻轻振荡后，加70%酒精固定，4℃保存过夜。用PBS离心洗涤细胞2次，沉淀细胞后溶于100μL PBS，分别加入FGF-2兔抗人单克隆抗体100μL，避光静置60min，加入鼠抗兔二抗工作液100μL，对照组只加二抗。避光静置60min，流式细胞仪检测SKOV3细胞中蛋白的表达量，以平均荧光强度表示蛋白的含量。

2 结 果

2.1 那可丁对卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制作用：随着药物浓度的增加，细胞的增殖抑制率总体呈增高趋势，但那可丁剂量组中40、80、160μmol/L组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。那可丁作用于SKOV3细胞24h的半数细胞增殖抑制浓度(inhibitory concentration 50,IC50)为46.77μmol/L，作用48h的IC50为22.66μmol/L，作用72h的IC50为19.08μmol/L，细胞的增殖抑制率随着作用时间的延长而增强(图1)。表明那可丁对SKOV3细胞的抑制存在时间和浓度依赖效应。

2.2 那可丁对卵巢癌SKOV3细胞形态的影响：对照组卵巢癌SKOV3细胞圆亮饱满，排布紧密，呈菱形或梭形，细胞间界限清楚并隐约可见细胞核。那可丁作用SKOV3细胞后，可见到部分细胞变小变圆、皱缩、破裂、脱落呈悬浮状，并见到细胞碎片，且那可丁浓度越高上述细胞形态学变化越明显(图2)。

图1 卵巢癌SKOV3细胞的增殖抑制率

Figure 1 The growth inhibition rate on human ovarian cancer SKOV3 cells

图2 卵巢癌SKOV3细胞形态学变化(×100)

A.对照组；B.20μmol/L那可丁组；C.40μmol/L那可丁组

Figure 2 The morphological changes of human ovarian cancer SKOV3 cells (×100)

A.Control group;B.20μmol/L narcotine group;C.40μmol/L narcotine group

2.3 那可丁对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响：与对照组SKOV3细胞凋亡率(2.87±0.94)%比较，10μmol/L那可丁组凋亡率(3.59±2.83)%差异无统计学意义(P>0.05)，20、40μmol/L那可丁组凋亡率分别增加至(10.59±2.99)%、(19.67±4.01)%，差异有统计学意义(P<0.05)。随着那可丁治疗浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增高，各剂量组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。表明那可丁能够诱导细胞凋亡，并具有剂量依赖性。

2.4 那可丁对卵巢癌SKOV3细胞周期的影响：与对照组相比，10μmol/L那可丁对SKOV3细胞周期无明显影响，而20μmol/L、40μmol/L 那可丁分别使G0/G1期细胞比例减少17.9%、48.6%，G2/M期细胞比例增加33.6%、89.7%，差异有统计学意义(P<0.05)。随着那可丁浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐降低，G2/M期细胞比例逐渐升高，40μmol/L那可丁组与10、20μmol/L那可丁组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。表明那可丁对SKOV3细胞具有G2/M期阻滞作用。

GroupsG0/G1SG2/M Control61.77±4.9721.36±3.6116.87±2.6510μmol/L narcotine54.45±6.7627.94±6.1217.61±4.2120μmol/L narcotine 50.73±2.66∗26.67±2.7822.53±2.53∗40μmol/L narcotine31.77±9.38∗#36.27±10.8732.00±1.80∗#

*P<0.05vscontrol group #P<0.05vs10,20μmol/L narcotine groups byANOVA

2.5 那可丁对卵巢癌SKOV3细胞FGF-2蛋白表达的影响：对照组FGF-2蛋白表达量为287.05±10.55，10、20、40μmol/L那可丁组蛋白表达量分别为284.56±6.33、268.78±7.56、250.72±5.21。与对照组相比，10μmol/L那可丁对FGF-2蛋白表达无显著影响，20、40μmol/L那可丁使FGF-2蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。随着那可丁浓度的增加，FGF-2蛋白表达逐渐降低，各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

目前临床上常用的微管蛋白抑制剂为长春新碱、紫杉醇等，虽然其疗效显著，但这类药物有毒性大、水溶性低的特点，并可导致脱发、骨髓抑制、神经病变以及胃肠道毒性等多种不良反应。那可丁也可作用微管，可使肿瘤细胞的纺锤体较早的灭活，导致细胞无法进行有丝分裂并引起肿瘤细胞死亡。那可丁不仅可以抑制非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、黑色素瘤、乳腺癌等多种癌细胞的增殖，而且对一些紫杉醇耐药细胞也有较好的抑制作用。本实验结果显示，那可丁明显抑制SKOV3细胞生长，并呈剂量和时间依赖性；那可丁作用于SKOV3细胞24、48、72h的IC50值分别为46.77、22.66、19.08μmol/L，与非小细胞肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、胶质细胞瘤的IC50值并不相同。表明那可丁对不同肿瘤细胞作用的敏感性也不一样[4]。进一步研究发现那可丁可诱导SKOV3细胞凋亡，那可丁作用后的SKOV3细胞变小皱缩，细胞间连接减少，细胞脱落呈悬浮状，见到细胞碎片，并出现凋亡的形态学改变。

细胞分裂的最主要环节是纺锤体和微管之间的互变，干扰这一过程的抗微管化合物均能够阻滞肿瘤细胞的有丝分裂和细胞增殖，进而诱导肿瘤细胞的死亡[5]。那可丁作用于神经胶质瘤细胞后，可使细胞周期素B1的表达增加，磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶表达水平减少，这些周期蛋白的改变与有丝分裂受损引起细胞死亡时蛋白的改变一致，证实那可丁在调节有丝分裂过程中起重要作用[6]。FGF-2是一种具有多种生物活性的细胞分裂促进因子，在细胞周期的转换中诱导并促进G0/G1期细胞进入S期，发挥促进细胞有丝分裂、生长和增殖的作用。FGF-2在卵巢癌患者癌细胞内高表达，并与肿瘤的发生、发展、浸润、转移密切相关[7]。本实验结果显示，那可丁可将SKOV3细胞阻滞于G2/M期，并降低细胞内FGF-2蛋白的表达，可能是那可丁诱导细胞的作用机制之一。

总之，那可丁具有抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖并诱导其凋亡的作用，其机制可能与SKOV3细胞G2/M期阻滞和FGF-2蛋白表达下调有关。

[1] 彭传真,赵永利,宋兆录,等.紫杉醇联合奈达铂与紫杉醇联合顺铂治疗晚期卵巢上皮性癌66例临床分析[J].河北医科大学学报,2010,31(11): 1369-1370.

[2] 梁梦,周英琼,肖胜军,等.甲基莲心碱对人卵巢癌顺铂耐药逆转的体外研究[J].山东医药,2011,51(1): 39-41.

[3] MAHMOUDIAN M,RAHIMI-MOGHADDAM P.The anti-cancer activity of noscapine: a review[J].Recent Pat Anticancer Drug Discov,2009,4(1): 92-97.

[4] 戴厚玲,郑剑斌,林敏,等.那可丁衍生物合成及其作为微管干扰药物的生物学评估[J].药学学报,2012,47(10): 1347-1357.

[5] 张素领,李贵霞,张丽霞,等.紫杉醇脂质体诱导骨肉瘤细胞MG-63凋亡及其机制的研究[J].河北医科大学学报,2013,34(1): 40-43,封三.

[6] NEWCOMB EW,LUKYANOV Y,SMIRNOVA I,et al.Noscapine induces apoptosis in human glioma cells by an apoptosis-inducing factor-dependent pathway[J].Anticancer Drugs,2008,19(6): 553-563.

[7] 封全灵,史惠蓉,乔丽娟,等.人成纤维细胞生长因子类似表达基因和成纤维细胞生长因子2在上皮性卵巢肿瘤组织中的表达[J].中华肿瘤杂志,2011,33(10): 770-774.