基于囊状银钯铂合金的无标记型癌胚抗原免疫传感器的研制

赵锦航，赵锦芝,李能丽,葛艳珊,钏爱祝,杨光莉,杨云慧

(云南师范大学化学化工学院,云南昆明650092)

0 引言

癌胚抗原（CEA）是1956年Gold 和Freedman首先从胎儿及结肠癌组织中发现的一种肿瘤相关抗原,为分子量为180-200KD 的多糖蛋白复合物。主要存在于直肠，结肠癌组织和胚胎肠粘膜上。这种抗原也存在于2～6个月胚胎的胃肠、肝脏和胰腺组织中，故名癌胚抗原，也称胚胎抗原(EA)或胎儿抗原（FA），可以在多种液体中检出[1]。CEA 作为一种最常见的肿瘤标记物，被广泛用作各种消化系统肿瘤的诊断及检测指标，CEA 的测量对治疗效果的观察同样有着不可忽略的作用，在临床中对于肿瘤疾病的诊断、治疗效果的判断和预后情况都有非常重要的临床意义[2～3]。

CEA 的检测方法有酶联免疫分析法、化学发光免疫分析法、放射免疫分析法等，这些方法特异性强，灵敏度高，但检测过程需要耗费较长的时间，样品消耗量也比较大，并且需要昂贵的专用仪器，对检测员的技术水平要求较高[4]。因此，迫切需要寻找一种价廉又便捷的免疫测定方法[5]。电化学免疫传感器将免疫分析技术与电化学传感器相结合，在临床医学、环境和食品工业等方面都有重要应用，并以其体积小、专一度强、灵敏度高、检测快速方便、成本低和容易实现实时、在线、活体检测等优点，成为当前研究的热点之一[6]。抗原和抗体在敏感膜上的结合和继后的反应引起电流发生改变，而且这种变化与待测抗原的浓度之间存在线性关系，因此可以实现对抗原浓度的检测[7]。其中将抗原或抗体，固定到换能器表面称为生物功能物质的固定化，固定化技术是免疫传感器的研究和开发中最为重要和关键的工作[8]。但由于一般常用固定材料固载抗原或抗体的量较少，从而影响免疫传感器的灵敏度[9]。因此，开发新型纳米材料，研制高灵敏免疫传感器及建立快速的检测癌胚抗原的方法具有重要的理论意义和潜在的应用价值[10]。

该文将中空囊状银钯铂合金修饰电极表面，用于固定癌胚抗原抗体，构建无标记型癌胚抗原免疫传感器。由于中空结构比普通的纳米材料具有更高的比表面积和反应活性位点，大大增加导电能力、催化性能、吸附能力[13～14]。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

CHI660D 电化学工作站（中国上海辰华仪器有限公司），使用三电极体系，其中自制修饰电极为工作电极，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极；SK2200HP 超声波清洗器（上海科导超声仪器有限司）；CS501型超级恒温器（中华人民共和国重庆实验设备厂）；FA1204B 电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；1KAMS3BASIC混旋仪；HJ-3 恒温磁力搅拌器。

癌胚抗原定量检测试剂盒（郑州博赛生物技术股份有限公司）；人绒毛膜促性腺激素试剂盒（郑州博赛生物技术股份有限公司）；甲胎蛋白测定诊断试剂盒（北京北方生物技术研究所）。

聚乙烯吡咯烷酮 （K-30）、磷酸盐缓冲溶液（PBS）、壳聚糖、牛血清白蛋白（BSA）购于美国sigma 公司；铁氰化钾、亚铁氰化钾、尿素购于天津市大茂化学试剂有限公司；无水乙醇、乙二醇购于成都格雷西亚化学技术有限公司；HNO3(1 ∶1)购于成都化学试剂厂；AgNO3、PdCl2、乙酰丙酮铂购于昆明铂锐金属材料有限公司；醋酸、甘氨酸、丙氨酸购于中国医药（集团）上海化学试剂公司。试验中所用的以上试剂均为分析纯，所用的水均为二次蒸馏水。

1.2 银钯铂合金的合成

取40 mL 乙二醇搅拌加热至150℃，通N2在三颈烧瓶回流活化1 h，再加90 mg AgNO3,反应1 h,再加60 mg PdCl2、130 mg 乙酰丙酮铂，通N2搅拌反应1 h，冷却至室温，产物用乙醇、水各洗三次，最后分散到二次蒸馏水中。

1.3 癌胚抗原免疫传感器的制备

1.3.1 电极预处理

将玻碳电极用金相砂纸打磨后，依次再用粒径为0.3、0.1 和0.05 μm 的Al2O3粉在麂皮上打磨，然后依次用HNO3(1∶1)、无水乙醇和蒸馏水超声清洗10 min。将电极取出用蒸馏水冲洗后置于室温下晾干。

液硫脱气效果达标后，联合装置硫磺回收单元涉及液硫脱气的设备如硫磺冷却器(E-309)、液硫输送管线等腐蚀现象大大减缓，腐蚀泄漏事件的发生率明显降低，联合装置连续运行周期增长，为装置的平稳运行提供了有效保障[8]。

1.3.2 癌胚抗原免疫传感器的制备

取4 μL 制备好的银钯铂合金溶液、4 μL 0.5%壳聚糖溶液和4 μL 120 μg/mL 癌胚抗原抗体，混合均匀后，移取10 μL 混合液滴在处理好的玻碳电极表面，过夜。

用PBS 缓冲液溶液清洗，晾干后取10 μL 1%的BSA溶液滴在电极上在37℃恒温培育1 h以封闭非特异性结合位点。然后用PBS 缓冲液清洗，制得癌胚抗原免疫传感器。电极不用时，置于冰箱中4℃保存。

1.4 实验原理及流程

以K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6为氧化还原探针，当癌胚抗原与抗体没有结合时，K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探针响应电流较大，当癌胚抗原与抗体结合时，覆盖了银钯铂合金的催化活性位点并增加的电化学探针的传质阻力，引起K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探针电流响应的减小，通过测量培育不同CEA浓度时电极电流的变化情况，从而实现对CEA含量的测定。实验原理图见图1。

图1 传感器的制备实验原理图Fig.1 Schematic diagram of the immunesensor

1.5 实验方法

制备好的癌胚抗原免疫传感器用PBS 缓冲溶液清洗后，晾干，取10 μL 不同浓度的CEA 滴加在传感器界面上，于37℃下培育30 min。

该实验在-0.1～0.5 V 电位范围内采用差示脉冲伏安法(DPV)，在含有5 mmol/L 铁氰化钾（0.01 mol/L PBS）的底液中，扫描速度4 mV/s，振幅50 mV,脉冲时间0.2 s,取样间隔0.016 7 s，脉冲周期0.5 s。对癌胚抗原与抗体结合时引起K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6探针电流的变化进行测定。

2 实验结果与讨论

2.1 中空囊状银钯铂合金纳米颗粒的微观形貌

用高倍透射电镜观察了中空囊状银钯铂合金颗粒的微观形貌特征。由图2可知中空囊状银钯铂合金颗粒的平均粒径约为100 nm，粒子成中空囊状，表明成功制备了中空囊状银钯铂合金纳米颗粒。

图2 中空囊状银钯铂合金颗粒的TEM 图Fig.2 TEM image of saccate AgPdPt alloy

2.2 氧化还原峰电流与扫描速度的关系

改变不同的扫描速度，考查了电极在5 mmol/L 铁氰化钾溶液中的循环伏安行为，结果见图3a (从内至外扫描速度分别为20、40、60、80、100、120 mV/s)。从图3b 中可以看出氧化还原峰电流与扫描速度的平方根成正比，说明电流受扩散控制。

2.3 银钯铂合金的催化作用

为考察银钯铂合金的催化效应，实验比较了有无银钯铂合金时，传感器在铁氰化钾溶液中的响应情况。

图3 扫描速率对氧化还原电流的影响Fig.3 The relationship between the redox peak current and scanning rate

图4为不同修饰电极测定铁氰化钾的DPV曲线，其中a为壳聚糖/银钯铂合金修饰电极对铁氰化钾的响应曲线，曲线b为空玻碳电极（GCE）对铁氰化钾的响应，从图中可以看出银钯铂合金纳米颗粒对铁氰化钾具有优异的催化性能，能够有效地放大响应信号。

图4 不同修饰电极在5 mmol/L 铁氰化钾底液中的DPV 曲线a为壳聚糖银钯铂合金修饰电极；b为空玻碳电极Fig.4 The DPV voltammograms of different electrodes at potassium ferricyanide solution(5 mmol/L).a.AgPdPt/chit/GCE;b.Bare GCE

2.4 实验条件优化

2.4.1 培育时间的选择

抗原-抗体免疫结合的程度与时间有关，考察了37℃条件下抗原培育时间对电极响应电流的影响，实验发现,培育30 min时,抗原-抗体反应已达平衡(如图5)，从图中可以看出30 min 及以后出现近似平台。因此选择30 min 作为培育时间。

图5 不同CEA 培育时间对电极的影响Fig.5 The effect of incubation time on the response current of immunosensor

2.4.2 固定抗体浓度的优化

固定抗体的量对电极的灵敏度和检测范围有很大影响，因此该文对抗体浓度进行了优化。浓度优化范围为12 μg/mL～600 μg/mL。从图6中可以看出120 μg/mL时电极的响应斜率最大，灵敏度最高。因此实验选取120 μg/mL 作为固定抗体的浓度。

2.5 癌胚抗原免疫传感器的响应性能

图7为在最优条件下癌胚抗原免疫传感器在不同浓度的CEA溶液中的标准曲线，在选取的最优条件下，氧化峰电流与CEA 浓度在0.5 ng/mL～80 ng/mL 之间呈现良好的线性关系，回归方程为I(μA)=-0.271 1(log c)+1.778 8,相关系数为0.989 0，检测下限为0.17 ng/mL。

2.6 传感器的重现性和稳定性

考察了该电化学传感器的重现性和稳定性。用同一根电极对同一浓度连续测定3次，其相对标准偏差为3.6%，说明重现性良好。循环扫描CV 100 圈以后，还原峰电流达到初始的94.25%，说明稳定性良好。

图6 抗体浓度对响应曲线线性斜率的影响Fig.6 The effect of antibody concentration on the linear slope

图7 癌胚抗原免疫传感器的校正曲线Fig.7 The calibration curve of the immunosensor to CEA

2.7 传感器的选择性

为了考察传感器的选择性，在所选择的优化条件下，在含有40 ng/mL 的CEA溶液中，分别加入了牛血清蛋白、丙氨酸、人绒毛促性腺激素（HCG），共3 种干扰物质进行干扰试验。测得的氧化峰电流I干扰+CEA与没有干扰物时测得的氧化峰电流ICEA的比值见表1，由表1可看出此传感器具有良好的抗干扰能力。

表1 传感器的抗干扰测试Tab.1 Possible interference tested with the immunosensor

2.8 回收率

为了考察传感器的实用性，用其测定了在稀释的人血清中CEA 的加标回收率，结果见表2。回收率在99.37%～105.45%之间。说明该传感器可用于CEA 的检测。

表2 传感器的回收率Tab.2 The recovery of immunosensor

3 小结

该实验利用中空囊状银钯铂合金修饰电极构建一种新型的无标记CEA 免疫传感器，通过优化条件，提高了CEA 传感器的灵敏度、选择性和稳定性，使传感器具有更宽的线性范围，较低的检测下限，为CEA 的检测提供了一个较好的方法。

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