两株H5N1高致病性禽流感病毒对小鼠的致病力研究

郭 晶，李旭勇，钟功勋，施建忠，李雁冰，陈化兰

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150001)

H5N1 亚型高致病性禽流感病毒(Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)是严重威胁社会公共卫生安全的人兽共患病病原。目前，H5N1亚型HPAIV 已在全球十几个国家有感染人的报道，其致死率超过60 %，对人类的健康构成了极大的威胁[1]。此外，H5N1 亚型的HPAIV 经过在自然界长期的进化，已经开始具备对多种哺乳动物的感染甚至是致死能力[2-3]。通常，关于H5N1 亚型的HPAIV对小鼠致病力的研究一直都采用高剂量的病毒进行感染[4-6]，然而在自然界动物甚至是人类直接接触到的病毒远达不到这样的剂量。因此，本研究模拟自然环境下小剂量HPAIV 感染小鼠，对该病毒在哺乳动物模型中致病力的研究具有重要的意义[7]。将两株不同来源的H5N1 亚型HPAIV，低剂量感染小鼠后分析两株病毒对小鼠的致病力差异、各器官中病毒复制滴度、病毒对组织的损伤等，为进一步了解自然环境中H5N1 亚型的HPAIV 感染哺乳动物后的发病进程提供了实验参考。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要试剂 H5N1 亚型的HPAIV A/Anhui/2/05(AH/2/05)为一株人源分离株，A/Sichuan/81/05(SC/81/05)为一株禽源分离株，两株病毒均属于我国南方水禽H5N1 亚型的HPAIV Clade 2.3.4 分支[3]，由本研究所国家禽流感参考实验室保存。所有涉及H5N1 亚型的HPAIV 的操作均在生物安全3级实验室中进行。受体破坏酶(RDE)购自Sigma 公司；免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；A 型流感病毒NP 单克隆抗体(MAb)由本实验室制备。

1.2 动物实验 6 周龄雌性BALB/c 小鼠经CO2轻度麻醉后，通过鼻腔接种10 EID50的病毒液。第一组感染病毒后每天称量计算平均体重并观察发病与存活情况。第二组分别于感染后不同时间点随机抽取3 只存活小鼠，经CO2麻醉后迫杀，采集不同器官，按照文献[3]方法分别进行病毒含量的滴定；同时分别于感染后的3 d、7 d 和10 d，随机选取3 只小鼠迫杀，采集肺、脑和脾脏，进行组织病理学检查。

1.3 病理学检查 小鼠脑、脾脏、肺脏分别经10%中性福尔马林溶液固定后，按常规包埋，制备石蜡切片，HE 染色后镜检。同时利用MAb，采用免疫组化试剂盒，按照说明书进行组织切片的免疫组化染色，检测组织细胞中的病毒抗原。

1.4 中和抗体测定 小鼠感染后的7 d、14 d 和21 d采血，分离血清，血清经过RDE 于37 ℃作用过夜，56 ℃灭活30 min。病毒经灭活剂灭活后配备4 单位抗原。处理的血清加入到96 孔V 型血凝板，并作2倍倍比稀释到212，加入到预配的4 单位抗原，轻微震荡96 孔血凝板，使抗原和抗体充分反应，室温静置30 min，加入0.5%的鸡红细胞，室温下作用15 min，观察并记录血凝结果。

2 结果

2.1 小鼠的发病和死亡情况 两株病毒AH/2/05 和SC/81/05 以10 EID50的剂量经鼻腔感染小鼠后连续14 d 称重观察，结果表明两株病毒对小鼠的致病力差异显著。AH/2/05 感染组的5 只小鼠在感染后的4 d即有一只小鼠死亡，至感染后的14 d 仅有一只小鼠存活。感染后的7 d 内体重和临床症状无明显变化，一周之后小鼠体重逐渐减轻，开始表现出严重的临床症状，主要表现为食欲下降、呼吸急促，以及共济失调、颤抖、运动迟缓等神经症状。至感染后的14 d 平均体重约下降到初始体重的90 %，超过半数的小鼠最终死亡，耐过的小鼠表现出轻微的神经症状。而SC/81/05 感染组的5 只小鼠无死亡，感染后平均体重逐步上升，至感染后14 d，其体重约上升至初始体重的115 %(图1)。

图1 AH/2/05 和SC/81/05 感染后14 d 小鼠体重变化(A)和存活情况(B)Fig.1 Weight change(A)and survival(B)of mice after inoculated with AH/2/05 and SC/81/05 viruses

2.2 病毒在体内的复制 以10 EID50剂量的病毒感染小鼠，感染后的3 d、5 d、7 d、10 d 和14 d 迫杀小鼠，取小鼠的脑、鼻甲、鼻相关淋巴组织(Nasal-associated lymphoid tissue，NALT)、脾脏、肾脏、肺脏进行病毒滴定。AH/2/05 感染小鼠后可以在小鼠的各个组织脏器中分离到高滴度的病毒。小鼠的肺脏在感染后3 d、5 d、7 d、10 d 和14 d 均能检测到病毒，在感染后7 d 病毒滴度最高达到107.0EID50/mL，在感染后14 d 病毒滴度下降到101.75EID50/mL。在感染后的7 d 小鼠的鼻甲病毒含量最高，是排毒的高峰，而在感染后的其他时间段则基本不排毒或很少排毒。同时，在感染后5 d、7 d 和10 d 在小鼠的NALT 中分离到病毒。脾脏和肾脏中病毒在感染后的5 d 和7 d 滴度较高，其它时间段基本检测不到病毒。在感染后的10 d 脑组织中的病毒滴度达到105.75EID50/mL，并且在第14 d 仍然可以检测到病毒。与AH/2/05 感染组截然不同，SC/81/05感染小鼠后，仅可以在感染后的3 d～5 d 小鼠的肺脏中分离到少量的病毒，其它脏器和组织均未检测到病毒(图2)。

图2 两株病毒感染小鼠后不同时间体内各脏器的病毒滴度Fig.2 Viral replication in different organs of mice at different time post infection with two viruses

2.3 组织病理学变化 被AH/2/05 感染的小鼠的肺组织病理切片中，观察到病毒对内脏器官造成了严重损害。感染初期肺脏无明显的病理变化，感染后的5 d 至14 d 肺脏呈现严重的病变，包括充血、渗出、实变、肺泡腔缩小、肺泡间隔增宽，以及大量的单核细胞渗出。在SC/81/05 感染组的小鼠脏器组织病理切片中，未观察到严重的病理变化。仅在感染后3 d 观察到肺泡腔轻微的缩小，肺泡间隔轻度增宽，在感染后的5 d、7 d、10 d 和14 d 肺组织恢复到正常状态，无明显病理变化(图3)。通过免疫组化检测，AH/2/05 感染组的小鼠在感染后3 d 可以在肺脏、脾脏、脑组织中均检测到大量病毒抗原，而SC/81/05 感染组的小鼠在感染后的3 d 仅在肺脏中可以检测到病毒抗原，脾脏和脑组织中未检测到病毒抗原(图4)。

图3 两株病毒感染后不同时间小鼠肺脏的组织病理学变化Fig.3 Histological lesions in lungs at different time post infection with two H5N1 viruses

图4 免疫组化检测不同组织中的病毒抗原结果Fig.4 Immunohistochemical detection of virus antigen in different organs of the infected mice

2.4 中和抗体水平 感染后7 d、14 d 和21 d 采集小鼠的血清，测定病毒的中和抗体水平。结果显示，AH/2/05 和SC/81/05 两个感染组的小鼠血清中的中和抗体水平差异较大。AH/2/05 组的小鼠在感染后的两周血清抗体水平相对较高，平均水平为260～320，在感染后3 周血清中的中和抗体水平稍有下降为213。而SC/81/05 感染组的小鼠在感染后的1 周血清抗体水平较低约133，感染后的2 周至3周血清中的抗体水平较高为266(图5)。

图5 AH/2/05 和SC/81/05 感染后3 周小鼠血清中HI 的抗体水平变化Fig.5 Serum HI antibody change of infected mice post inoculated with AH/2/05 and SC/81/05 influenza viruses at day 7,14 and 21

3 讨论

目前，由于小鼠是研究流感病毒一个比较理想的哺乳动物模型，国内外许多关于H5N1 亚型HPAIV 对哺乳动物致病性的研究都采用小鼠模型进行[6-8]。在关于HPAIV 对哺乳动物的致病性研究中，采用低剂量的H5N1 HPAIV 感染小鼠能够更接近于宿主自然感染的状态，为人们提供了新的研究思路，有助于更真实的研究HPAIV 感染哺乳动物后，病毒在宿主体内的复制过程，对宿主各个脏器的损害情况，宿主体内抗体和细胞因子等的变化。

人源病毒AH/2/05 和禽源病毒SC/81/05 是H5N1亚型HPAIV，属于我国南方水禽系禽流感病毒群，为Clade2.3.4 分支[3]。本研究选取了这两株病毒，采用低剂量对小鼠进行感染试验，结果显示AH/2/05 在哺乳动物模型小鼠体内的有效复制能力长达14 d，该病毒对神经系统有极强的组织嗜性，并且对小鼠有高度的致死能力；而SC/81/05 在小鼠体内局限性复制，仅于3 d～5 d 在小鼠的肺脏检测到病毒，组织脏器没有明显损伤，不引起小鼠临床症状，不造成小鼠死亡。两株病毒AH/2/05 和SC/81/05 序列分析，结果显示它们的基因组高度同源，仅有27 个氨基酸不同，但对小鼠致病力截然不同，这为进一步研究HPAIV 致病机制奠定了实验基础。此外，本研究将我国的AIV Clade2.3.4 亚群的代表株AH/2/05 对哺乳动物模型小鼠的致病力进行了系统分析，证明了该病毒对哺乳动物具有非常强的感染、复制和致死能力，为我国防止该亚群病毒在我国的扩散以及研究人类在感染HPAIV 后的病理进程提供了相关的依据。

[1]Chan P K S.Outbreak of avian influenza A(H5N1)virus infection in Hong Kong in 1997[J].Clin Infect Dis,2002,34(Supplement 2):58-64.

[2]Chen Hua-lan,Deng Guo-hua,Li Ze-jun,et al.The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in Southern China[J].PNAS USA,2004,101(28):10452-10457.

[3]Li Yan-bing,Shi Jian-zhong,Zhong Gong-xun,et al.Continued evolution of H5N1 influenza viruses in wild birds,domestic poultry,and humans in China from 2004 to 2009[J].J Virol,2010,84(17):8389-8397.

[4]Li Ze-jun,Chen Hua-lan,Jiao Pei-rong,et al.Molecular basis of replication of duck H5N1 influenza viruses in a mammalian mouse model[J].J Virol,2005,79(18):12058-12064.

[5]Lipatov A,Kwon Y,Pantin-Jackwood M J,et al.Pathogenesis of H5N1 influenza virus infections in mice and ferret models differ between respiratory and digestive system exposure[J].J Infect Dis,2009,199:717-725.

[6]Lu Xiu-hua,Tumpey T M,Morken T,et al.A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A(H5N1)viruses isolated from humans[J].J Virol,1999,73(7):5903-5911.

[7]李旭勇，郭晶，施建忠，等.H5N1 禽流感病毒低剂量感染小鼠发病模型的建立[J].中国预防兽医学报，2011，33(7)：503-506.

[8]Fan Shu-fang,Gao Yu-wei,Shinya K,et al.Immunogenicity and protective efficacy of a live attenuated H5N1 vaccine in nonhuman primates[J].PLoS Pathogens,2009,(5):e1000409.