通过改进Red重组方法快速构建肠炎沙门菌毒力岛SPI-1缺失株

吕雪莲，于申业，倪宏波，衣 菲,2，田秋丰,2，刘思国

(1.黑龙江八一农垦大学 动物科技学院，黑龙江 大庆 163319；2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病研究室，黑龙江 哈尔滨 150001)

肠炎沙门菌(Salmonella enterica)是引起人类食源性疾病的主要革兰阴性菌之一，并可以导致禽类、家畜等哺乳动物产生不同的疾病。沙门菌的致病力与其毒力基因密切相关，SPI-1 和SPI-2 是沙门菌的两个重要毒力岛，其中SPI-1 主要编码Ⅲ型分泌系统(T3SS)通过宿主的细胞膜转运肠炎血清蛋白，此外，研究表明SPI-1 能够侵染细胞诱导巨噬细胞产生细胞毒性[1-2]。SPI-1 编码序列约为40 kb，具有一定的稳定性，在自然分离株中极少存在SPI-1 部分或全部缺失的情况[3]。Red 重组是革兰阴性菌最常用的反向遗传操作系统，常规的方法是利用λ 噬菌体Red 重组酶将导入细胞的线性DNA 片段与染色体(或载体)的特定靶序列进行同源重组[4]。本研究室前期基于I-SceI 酶切原理对Red 同源重组系统进行改进，提高了重组效率、缩短了实验周期。本实验利用改进的系统对S.enterica 毒力岛SPI-1 进行一步法敲除，为其生物学特性的研究提供了依据。

1 材料和方法

1.1 菌株及质粒 S.enterica SM6、E.coil DH5α、Red 重组系统工具质粒pKD3、pCP20 及pET-28a 均由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所细菌室保存；温敏复制型质粒pKD46a(基于pKD46 质粒骨架，经L-阿拉伯糖诱导后可产生Exo、Gam 和Bet 3 种同源重组酶以及I-SceI 酶)由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所细菌室构建。

1.2 主要试剂 L-阿拉伯糖购自Sigma 公司；PCR试剂购自TaKaRa 公司；限制性内切酶、T4 连接酶购自MBI 公司；DNA 胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物设计及合成 根据GenBank 中登录的沙门菌毒力岛SPI-1 基因序列(FJ496648.1)设计引物S1/S2 扩增上游同源臂、S3/S4 扩增下游同源臂。氯霉素抗性基因片段的扩增引物为C1/C2，质粒pKD46a 的鉴定引物为P1/P2，毒力岛SPI-1 敲除后的鉴定引物为D1/D2(表1)，引物由博仕生物技术有限公司合成。

1.4 S.enterica感受态细胞的制备 将S.enterica 在LB 液体培养基中过夜培养，按1∶100 转接到100 mL LB 培养基，培养至OD600nm约为0.4 时，冰浴预冷10 min～30 min。先后以预冷的无菌水和10 %甘油各离心洗涤2 次，将菌体悬浮于600 μL 10 %甘油中，分装后-80 ℃冻存。

表1 PCR 引物序列Table 1 Primers used in this study

1.5 打靶质粒的构建 以质粒pKD3 为模板，扩增氯霉素抗性片段；以SM6 为模板，扩增毒力岛SPI-1 上游和下游同源臂，PCR 产物纯化经相应酶切后胶回收。氯霉素抗性片段与载体pET-28a 连接，转化到E.coil DH5α 中，PCR 与测序鉴定正确后，分别在氯霉素抗性片段的上下游连接SPI-1 上下游同源臂，重组质粒命名为pET-SPI-1FCmR。

1.6 电转化以及Red重组系统的诱导 取质粒pKD46a 和pET-SPI-1FCmR 各1.5 μL 加入S.enterica感受态细胞中混匀，冰浴10 min，进行电转化。转化菌涂布于含氨苄青霉素(100 μg/mL)、卡那霉素(50 μg/mL)和氯霉素(30 μg/mL)的LB 平板上，30 ℃培养24 h。挑取单菌落进行PCR 鉴定，获得共转化重组菌。

将菌液转接于含有氨苄和氯霉素的LB 培养基中，30 ℃220 r/min 培养至OD600nm约为0.3，加入L-阿拉伯糖至终浓度30 mmol/L，30 ℃180 r/min 诱导1 h，30 ℃静置培养7 h～11 h，涂布含有氨苄青霉素和氯霉素的LB 平板，30 ℃静置培养12 h 后挑取单克隆进行PCR 鉴定。阳性菌株命名为SM6ΔSPI-1::cat。

1.7 氯霉素抗性基因的敲除 按1.4 方法制备SM6ΔSPI-1::cat 感受态细胞，将pCP20 质粒转入其中，涂布于含氨苄青霉素的LB 平板，30 ℃静置培养24 h，挑菌鉴定正确后，转接到无抗性的LB 培养基中，42 ℃220 r/min 诱导15 h～16 h 使FLP 重组酶表达。生长的菌落分别点到含氨苄青霉素的平板和氯霉素的平板上，两个平板对应的位置均不长菌，利用鉴定引物D1/D2 进行PCR 鉴定，正确后的菌株命名为SM6ΔSPI-1。

1.8 体外遗传稳定性的检测 挑取单个菌落接种于LB 培养基中，37 ℃220 r/min 培养至对数期，按1∶100 转接到新鲜的LB 培养基中，连续传代，取第5、10、15、20、25 及30 代菌液利用鉴定引物进行PCR 鉴定，检测缺失菌株的遗传稳定性。

1.9 生长速率的比较 为对比缺失株SM6ΔSPI-1与野生株SM6 的生长状态有无差异，分别挑取二者的单菌落接种于LB 培养基中，37 ℃220 r/min 过夜培养，将其按1∶100 比例分别转接到5 mL LB 培养基中，调整初使菌液浓度(OD600nm约为0.05)，37 ℃220 r/min 培养，每隔1 h 取200 μL 菌液测定OD600nm值，直至细菌生长处于稳定期，重复试验3 次，绘制SM6ΔSPI-1 和SM6 的生长曲线。

1.10 统计分析 所有数据采用SPSS17.0 软件进行统计分析。

2 结果

2.1 缺失株SM6ΔSPI-1的构建与鉴定

2.1.1 打靶质粒pET-SPI-1FCmR 的构建 将氯霉素抗性片段、SPI-1 上游和下游同源臂分别连入pET-28a 载体构建重组质粒pET-SPI-1FCmR，并以T7/T7ter 为引物鉴定重组质粒，结果显示，PCR 产物约2 500 bp(图1)，测序结果与预期2 478 bp 一致。

图1 重组质粒pET-SPI-1FCmR 的PCR 鉴定Fig.1 PCR product identified recombinant plasmid of pET-SPI-1FCmR

2.1.2 质粒的共转化 将pET-SPI-1FCmR 和质粒pKD46a 共转入S.enterica 感受态细胞中，以引物P1/P2 进行PCR 鉴定，结果显示扩增产物约500 bp，与预期相符(图2)。

2.1.3 氯霉素抗性基因的敲除与PCR 鉴定 将pCP20 质粒转入阳性菌株中，热诱导消除氯霉素抗性基因，构建缺失菌SM6ΔSPI-1，以SM6ΔSPI-1 和SM6ΔSPI-1::cat 为模板，利用引物D1/D2 和T7/T7ter进行PCR 鉴定，结果显示扩增产物分别约为1 500 bp和2 500 bp，大小与预期相符，表明氯霉素基因已经从SM6ΔSPI-1::cat 中敲除，野生株SM6 毒力岛SPI-1 基因序列约为40 kb，片段过长，因此PCR 扩增结果为阴性(图3)。

图2 pKD46a 转化到Salmonella 的PCR 鉴定Fig.2 Identification of the plasmid pKD46a in transformed Salmonella by PCR

图3 缺失株SM6ΔSPI-1 的PCR 鉴定Fig.3 Identification of the SM6ΔSPI-1 by PCR

2.2 S.enterica毒力岛SPI-1缺失株的体外遗传稳定性 对S.enterica 缺失株进行体外连续传代，取第5、10、15、20、25、30 代单菌落利用引物D1/D2进行PCR 鉴定，结果显示未发生回复突变，表明缺失菌株能够在体外稳定遗传(图4)。

2.3 SM6与SM6ΔSPI-1生长速率的比较 在相同条件下培养SM6 和SM6ΔSPI-1，并且每间隔1 h测一次OD600nm值，绘制生长速率曲线。结果显示SM6ΔSPI-1 在体外正常生长并且SM6ΔSPI-1 生长速率高于SM6，SM6ΔSPI-1 与SM6 在6 h～9 h 生长速率相比差异显著(p<0.05)(图5)。

图4 SM6ΔSPI-1 遗传稳定性PCR 鉴定结果Fig.4 Stability test of the SM6ΔSPI-1 by PCR

图5 缺失菌株与野生菌株生长速率的比较Fig.5 Growth rate of mutant strain SM6ΔSPI-1 and the wild stain SM6

3 讨论

基因敲除是研究微生物蛋白功能重要的方法。细菌基因敲除有多种策略，包括非复制型质粒载体敲除法、不稳定型质粒载体敲除法、温度敏感型质粒载体敲除法、线形转化敲除法和结合转化敲除法[5]。同源重组是目前最常用的细菌基因突变方法，Red重组技术应用于沙门菌染色体DNA、大肠杆菌染色体DNA、细菌人工染色体基因组DNA 中，Red 重组技术也可以精确修饰不同大小的DNA 分子[6-9]。

由于毒力岛SPI-1 编码的碱基长达40 kb，应用的常规Red 重组方法难以将S.enterica 毒力岛SPI-1敲除。本实验室前期基于I-SceI 酶切原理对pKD46质粒进行改造，构建pKD46a。本研究利用这种改进的Red 重组系统，通过一步法构建了SM6ΔSPI-1，不需要再将毒力岛基因进行逐段敲除。改进的Red系统与常规方法相比具有快速、准确、高效的优势。

另外，SM6ΔSPI-1 遗传稳定性试验显示，SM6ΔSPI-1 具有良好的遗传稳定性。SM6ΔSPI-1 的生长速率较SM6 快，表明毒力岛SPI-1 的缺失可能减少SM6 生长负担，推测SPI-1 中某些组分的合成导致沙门菌生长变缓。本实验还在敲除毒力岛SPI-1过程中检测了几代菌液制成感受态细胞，结果显示传10 代后的菌液更利于质粒pCP20 的导入。表明菌液里的pKD46a 质粒影响质粒pCP20 的转入，传代次数增多使质粒pKD46a 自然丢失。总之，S.enterica 毒力岛SPI-1 的敲除为其后续功能研究奠定了基础，为制备基因工程减毒疫苗提供一种快捷的缺失方法。

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