启动子p7.5/p11在山羊痘病毒和羊口疮病毒中的启动功能验证

李继东，朱学亮，李 辉，骆学农，窦永喜，才学鹏*

(1.中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室/甘肃省动物寄生虫病重点实验室，甘肃 兰州 730046；2.宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021)

痘病毒科脊椎动物痘病毒亚科中的成员是目前已知最大的动物病毒，其基因组DNA 约为300 kb，可以容纳较大的外源基因。此外，该病毒科成员还具有严格的宿主特异性。目前有多种痘病毒已作为活载体疫苗得到了开发和应用，如痘苗病毒(Vaccinia virus，VACV)、禽痘病毒(Fowl pox virus，FPV)、羊痘病毒(Capripoxvirus，CPV)等，这类病毒的重组毒株作为候选疫苗，其免疫效果得到了证实[1-3]。为实现外源基因的高效表达，在构建转移质粒时需要选用强启动子，因此对于启动子功能的鉴定显得尤为重要[4-5]。目前，重组痘病毒活载体疫苗的研究中广泛采用的启动子主要是VACV 的启动子，如早/晚期启动子(p7.5/p11)。在重组VACV、FPV、CPV的研究中，这两个启动子被采用的频率最高[2,6-10]。

目前，大量研究主要集中于各种重组痘病毒的构建及其免疫效力测定方面，尤其是在重组山羊痘病毒(Goat pox virus，GPV)中，只是采用了VACV的启动子作为转移载体构建的元件，其载体设计策略还需要进一步优化。另外，作为病毒载体，属于副痘病毒属的羊口疮病毒(Orf virus，ORFV)也是一个很有发展前景的候选活载体疫苗[11]。目前关于VACV 启动子在ORFV 中的功能研究鲜有报道。

本研究构建携带VACV 启动子的质粒，通过报告基因的表达来验证启动子p7.5/p11 在GPV 和ORFV 中的启动功能，初步探索在重组ORFV 的相关研究中使用VACV 启动子的可能性。同时构建了用于GPV 重组的通用转移质粒，并在通用质粒中插入外源基因，与GPV 共转染细胞，获得了一株重组GPV(rGPV)，拓展并实践了重组GPV 的相关研究。

1 材料和方法

1.1 病毒株及主要试剂 GPV 疫苗株AV41、ORFV 疫苗株及小反刍兽疫病毒(PPRV)疫苗株Nigeria 75/1 均由中国农业科学院兰州兽医研究所保存。E.coli DH5α 菌株和Trans2K plus ⅡDNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit、AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit 购自Axygen 公司；限制性内切酶及相关酶类购自NEB 公司；质粒pIRES2-AcGFP1 和PrimeSTAR®HS DNA Polymerase 购自TaKaRa 公司；LipofectamineTM2000 购自Invitrogen 公司；EndoFree Plasmid Kit 购自QIAGEN 公司；霉酚酸(MPA)、黄嘌呤(Xanthine)、次黄嘌呤(Hypoxanthine)购自Sigma 公司；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、TRIzol Regeant 购自Thermo Fisher 公司；TRITC 标记的IgG(TRITC-IgG)购自Abcam 公司。PCR 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

表1 引物和PCR 产物Table 1 Primers and PCR products

1.2 重组质粒的构建及鉴定

1.2.1 重组质粒的构建方案 质粒pTKpp 由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜寄生虫病实验室设计、构建，含有VACV 启动子p11 和p7.5(图1)。分别在两个启动子下游插入报告基因，构建重组质粒pTKp-gpt-i-GFP-p 和pTKpp-H-i-GFP(图1)。

图1 重组质粒构建示意图Fig.1 Schematic of the recombinant plasmids construction

1.2.2 目的DNA 片段的扩增及重组质粒构建 以pIRES2-AcGFP1 为模板，PCR 扩增的GFP-IRES 片段以及以E.coli DH5α 基因组为模板，扩增的gpt 基因，分别用SacⅠ/XhoⅠ和XhoⅠ/SalⅠ进行酶切，插入pTKpp 启动子p11 下游的MCS A 中，构建重组质粒pTKp-gpt-i-GFP-p。将PCR 扩增的PPRV H基因用NheⅠ/Bam HⅠ酶切，IRES-GFP 片段用Bam HⅠ/NotⅠ从质粒pIRES2-AcGFP1 中切下，将目的片段连接于质粒pTKpp 启动子p7.5 下游的MCS B 中，构建重组质粒pTKpp-H-i-GFP。重组质粒测序鉴定。相关引物序列见表1。

1.3 p7.5和p11启动报告基因瞬时表达的验证按常规方法制备羔羊睾丸(Lamb testis，LT)原代细胞。将LT 细胞铺至6 孔细胞培养板生长至90 %时，按0.1 个感染复数(MOI)分别接种GPV 或ORFV 疫苗毒，感作2 h。弃去毒液，将pTKp-gpt-i-GFP-p 和pTKpp-H-i-GFP 按转染试剂盒说明书方法分别进行转染。每孔细胞用重组质粒2 μg～3 μg，转染24 h后在荧光显微镜489 nm 激发条件下检测荧光。

1.4 含有p7.5和p11的重组转移质粒在rGPV中的应用

1.4.1 rGPV 的制备、筛选及纯化 以pTKpp 质粒为基础，将GPV tk 基因及其侧翼序列作为同源臂(ftk L 和ftk R)构建用于GPV 重组的通用转移质粒pTKfpgigp(图2)。随后，扩增PPRV-F 基因(引物见表1)，将PPRV-F 基因用NheⅠ/NotⅠ酶切，连接于pTKfpgigp 的MCS 中，构建重组转移质粒pTKfpgigp-F(图2)。

图2 重组转移质粒pTKfpgigp-F 结构图Fig.2 Map of the constructed transfer plasmid pTKfpgigp-F

将LT 细胞铺至6 孔细胞培养板生长至90 %时，按0.1 个MOI 接种GPV 疫苗毒，用LipofectamineTM2000 转染重组质粒pTKfpgigp-F。转染48 h 后在荧光显微镜下检测荧光，同时观察细胞病变(CPE)。当CPE 达到90 %并且有绿色荧光出现时，将细胞培养物(作为第一代重组病毒)收于-70 ℃保存。

将制备的LT 细胞铺于96 孔板中，待细胞形成单层，换选择培养液(DMEM，含2.5 % FBS，MPA 25μg/mL，Xanthine250μg/mL，Hypoxanthine15μg/mL)孵育16 h～24 h 后，弃去培养液。将转染后得到的重组病毒混悬液反复冻融3 次，稀释102～104倍后，接种于96 孔板中经选择培养液孵育过的LT 细胞上，37 ℃感作2 h，换选择培养液继续培养。观察细胞的CPE 及荧光情况，当出现带有绿色荧光的病毒蚀斑时，将其进行病毒蚀斑克隆传代纯化，获得纯化的rGPV 命名为rGPV/PPRV-F。

1.4.2 rGPV/PPRV-F 中F 基因表达的鉴定 按0.1个MOI 的接种量，将rGPV/PPRV-F 接种培养于24孔板中生长至85 %的单层LT 细胞中，并设立GPV对照孔和空白细胞对照孔。当细胞发生轻度CPE 时(约72 h)弃去培养液，按照免疫荧光试验(IFA)操作程序进行F 基因表达产物的检测。一抗为兔抗PPRV 高免血清(1∶100)，二抗为羊抗兔TRITC-IgG(1∶200)。

2 结果

2.1 目的DNA片段PCR扩增及重组质粒构建 以pIRES2-AcGFP1 为模板，PCR 扩增得到GFP-IRES片段(1 326 bp)；以E.coli DH5α 基因组为模板，PCR得到gpt 基因(477 bp)；以PPRV cDNA 为模板，PCR扩增H 和F 基因，其大小分别为1 858 bp 和1 669 bp(图3)。

图3 目的DNA 片段PCR 产物电泳图Fig.3 Amplifications of the target genes by PCR

将扩增的目的基因分别克隆于质粒pTKpp 中，构建用于检测p7.5/p11 启动子瞬时表达功能的重组质粒pTKp-gpt-i-GFP-P 和pTKpp-H-i-GFP(图1)以及构建rGPV 的重组转移质粒pTKfpgigp-F(图2)，并将其进行酶切鉴定和DNA 测序，结果与预期相符。

2.2 p7.5和p11启动GFP的瞬时表达结果 将pTKp-gpt-i-GFP-p 和pTKpp-H-i-GFP 分别转染预感染GPV 或ORFV 的LT 细胞，转染后24 h 即可观察到绿色荧光，约48 h 荧光达到峰值(图4)，表明重组质粒中的两个启动子p7.5 和p11，分别启动了GFP的正常表达。

图4 鉴定p7.5/p11 在感染GPV 或ORFV 的LT 细胞中启动GFP 的瞬时表达Fig.4 Identifications of the GFP transient expressions under the control of p7.5/p11 promoters with help of GPV or ORFV infection in LT cells

2.3 rGPV的制备、筛选及纯化结果 将重组转移质粒pTKfpgigp-F 转染于GPV 预感染的LT 细胞进行同源重组，通过选择培养液进行压力筛选和GFP标记双重筛选rGPV，并将rGPV 进行3～5 代连续蚀斑克隆纯化，获得了在LT 细胞中稳定表达GFP及产生CPE 的重组病毒rGPV/PPRV-F(图5)。

图5 鉴定rGPV/PPRV-F 在感染的LT 细胞中GFP 的稳定表达Fig.5 Identification of the GFP stable expression under p11 promoter in LT cells infected rGPV/PPRV-F

rGPV/PPRV-F 在LT 细胞中传代培养约10 代次后，对其毒价(TCID50)进行了测定。rGPV/PPRV-F 的病毒滴度为5×106TCID50/mL，而GPV 疫苗毒则高达1×1011TCID50/mL。由此表明，在tk 基因中插入外源DNA，对GPV 的生长产生了很大影响，导致rGPV 在LT 细胞中的增殖速度显著降低。

2.4 rGPV/PPRV-F中F蛋白的IFA检测结果 以PPRV 兔抗阳性血清为一抗，羊抗兔TRITC-IgG 为二抗，对rGPV/PPRV-F 中F 基因在LT 细胞中的表达产物进行IFA 检测。结果显示，rGPV/PPRV-F 感染LT 细胞48 h～72 h 后呈现明亮的红色荧光，表明rGPV/PPRV-F 中F 蛋白得到了稳定的表达(图6)。

3 讨论

图6 PPRV F 蛋白在rGPV/PPRV-F 感染LT 细胞表达的鉴定Fig.6 Identification of PPRV F protein stable expression under p7.5 promoter in rGPV/PPRV-F-infected LT cells by IFA

在重组VACV、FPV、GPV 的研究中，广泛采用的启动子为VACV 的启动子p11 和p7.5。为便于构建CPV 活病毒载体，本实验室参考NCBI 数据库中的p11 和p7.5 序列，将其作为启动子元件以反向形式连接[12]，使其各自启动一个下游外源基因的表达，并在两个启动子下游分别引入了多克隆位点(MCS)，构建了质粒pTKpp。以该质粒为基础，构建了可用于GPV 重组的通用转移质粒pTKfpgigp，以方便rGPV 的制备。由于上述质粒均由本实验室独立构建，因此对于p7.5 和p11 启动功能的验证显得尤为重要。

本研究结果显示，不论是p11，还是p7.5，在感染GPV 的LT 细胞中都执行了正常的启动功能，能够启动报告基因GFP 的表达。由于GFP 基因被置于IRES 序列下游，其正常表达证明了IRES 序列下游的基因也进行了正常转录。在本实验中p11 表达盒的结果与陈伟业等的研究结果一致[13]。作为不同时相启动子的p7.5[14-15]，启动其下游表达盒的情况和p11 相同，表明这两个启动子对于以IRES 序列分割的两个基因都可以启动其正常转录。

在重组ORFV 的研究中，启动子p11 和p7.5 很少被采用作为外源基因表达的调控元件[16-17]。本实验在感染ORFV 的LT 细胞中，p7.5 和p11 也能够有效启动报告基因GFP 的表达，证明p11 和p7.5 同样可以被ORFV 识别。此外，在现有重组ORFV 的研究中，还没有引入IRES 序列作为基因表达调控元件的报道[11,16-17]，本研究结果为ORFV 疫苗载体的进一步优化提供了实验依据。关于p11 和p7.5 在ORFV 中启动功能强弱的问题，本研究没有涉及。在重组ORFV 中，这两个启动子的作用能否超过目前已经采用的启动子，还需要进一步研究。

以启动子p7.5 和p11 为基础构建的重组GPV通用转移载体pTKfpgigp，在同源重组过程中，将其携带的目标DNA 重组于GPV 基因组中，产生了含有特定外源基因的rGPV。该研究结果和其它关于VACV、FPV 及GPV 的重组实验结果一致，证明该通用转移质粒可以用于rGPV 的构建。由此，启动子p7.5 和p11 的功能在rGPV 的基因表达中得到了进一步验证。

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