多级溶剂萃取-气相色谱测定羊奶中致膻游离脂肪酸

杨春杰，丁　武，马利杰（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

多级溶剂萃取-气相色谱测定羊奶中致膻游离脂肪酸

杨春杰，丁武*，马利杰
（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌712100）

目的：建立了多级溶剂萃取-气相色谱测定羊奶中致膻游离脂肪酸（己酸、辛酸、癸酸）的方法。方法：样品经过氯仿-甲醇（2∶1，v/v）溶液、碳酸钠碱性溶液多级溶剂萃取浓缩，并经三氟化硼甲醇溶液（14%，w/w）酯化后，用配备氢火焰离子化检测器（FID）的气相色谱测定。结果：己酸、辛酸、癸酸的线性范围分别为5.11～163.52、5.05～161.73和7.54～241.38mg/L，决定系数R2均大于0.998；三种游离脂肪酸的检出限和定量限分别在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范围内；加标回收率分别为88.5%、91.9%和103.4%，方法相对标准偏差为1.98%～6.09%。结论：本方法经济、准确、灵敏度高，适用于液态奶产品中这几种游离脂肪酸的检测。

多级溶剂萃取，甲酯化，气相色谱，游离脂肪酸，羊奶

羊奶营养价值丰富，全世界年产量达2200多万吨，但是大部分消费者不适应其存在的独特风味—膻味，限制了羊奶业消费人群的发展[1-3]。羊奶中含有3%左右的脂质（主要是甘油三酯），游离脂肪酸（FFA）含量少，稳定性较差[4]。羊奶中的游离脂肪酸，特别是游离己酸、辛酸和癸酸对膻味的形成起显著作用[5]，这些游离脂肪酸的含量超过一定浓度，这种膻味就会加强[6]。因此，这几种游离脂肪酸的检测对羊奶膻味的研究与控制十分重要。

国际上一直没有奶中游离脂肪酸的标准测定方法，目前常用的分析方法是气相色谱法，如固相萃取-气相色谱[7-11]、固相微萃取-气相色谱[12-14]和毛细管电泳[15]等。固相萃取-气相色谱对萃取柱、洗脱液选择要求较高；固相微萃取-气相色谱的检测对象是密封奶样的顶空平衡气，未能准确反映奶样中FFA含量，特别是长链不挥发游离脂肪酸的含量。同时，这两种方法大都需要配备专门的萃取设备，且萃取柱专一性强、易损耗、价格偏高。毛细管电泳法虽然步骤简单，但检测限偏高。多级溶剂萃取技术结合气相色谱测定游离脂肪酸的方法简单、经济，目前该方法只是在酒类，如黄酒、啤酒游离脂肪酸的检测中有所应用[16-17]，同时相关研究未对萃取溶剂做进一步优化选择。本研究拟采用优化的多级溶剂萃取出游离脂肪酸，然后用气相色谱定量测定这三种游离脂肪酸，以期建立一种简单、经济的液态奶产品中游离脂肪酸的检测方法，为奶产品风味品质特别是羊奶膻味控制研究提供技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

羊奶取自西北农林科技大学西农萨能奶山羊原种场畜牧基地，经65℃下杀菌30min后于4℃密封贮藏；己酸（C6∶0，纯度≥99.5%）、辛酸（C8∶0，纯度≥99.5%）、癸酸（C10∶0，纯度≥99.5%）和壬酸（C9∶0，内标，纯度≥99.5%）标准品阿拉丁公司；三氟化硼甲醇溶液（14%，w/w） 德国CNW公司；正己烷（色谱纯） 阿拉丁公司；氯仿、甲醇、无水乙醇、浓盐酸、浓硫酸、碳酸钠、氯化钠、无水硫酸钠均为市售分析纯；水双蒸水。

GC-2014C气相色谱仪配有FID检测器日本岛津公司；BT25S分析电子天平德国Sartorius公司；旋口玻璃管美国Hach公司；移液枪10～100μL、100～1000μL，德国Eppendorf公司。

1.2实验方法

1.2.1内标溶液的制备准确称取壬酸20.00mg，用无水乙醇定容至100mL，配制成200.00mg/L的内标溶液。

1.2.2工作标准贮备溶液准确称取己酸50.00mg、辛酸50.00mg、癸酸75.00mg于一旋口玻璃管，加入三氟化硼甲醇溶液2mL，80℃水浴酯化20min，冷却后加入1mL饱和氯化钠溶液，2mL正己烷萃取5次，收集有机相并用正己烷定容至25mL，得到混合标准母液；准确称取壬酸（内标）50.00mg置于一旋口玻璃管，如上述酯化、萃取处理后定容至25mL，得到2000.00mg/L的内标母液；分别吸取混合标准母液25、50、100、200、300、400、500、600、700和800μL，各加入500μL的内标母液，正己烷定容至10mL，得到一系列不同浓度混和标准品溶液，按浓度从小到大依次编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。以上标准溶液于-40℃密封保存，使用时稀释配制。

1.2.3色谱条件色谱柱：DB-17石英毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm）；检测器：FID；载气：高纯氮气；进样口温度：260℃；检测器温度：280℃；色谱柱升温程序：初始温度120℃，保持5min，以4℃/min升至240℃，保持15min；柱前压（载气N2为100kPa，H2为75kPa，空气为50kPa）；进样量：2μL；分流比为1∶5。

1.2.4样品制备取10mL羊奶置于50mL旋口离心管，加入500μL内标溶液、2g NaCl，混匀后加入1mL 2.5mol/L的H2SO4溶液。用25mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，v/v）连续萃取两次，每次1.5h，收集有机相。有机相用5mL 50g/L的Na2CO3溶液连续萃取3次，收集水相。水相用5mol/L的HCl溶液调节pH至2.0，然后用5mL氯仿-甲醇溶液（2∶1，v/v）连续萃取3次，收集有机相。有机相经无水硫酸钠脱水后移入旋口玻璃管。氮吹浓缩到约0.5mL，加入1mL三氟化硼甲醇（14%，w/w）溶液，密封后于80℃水浴酯化20min。冷却后加入1mL饱和NaCl溶液、1mL正己烷，收集有机相至进样瓶待分析。

1.2.5样品的测定和计算根据保留时间进行定性，根据相对质量校正因子进行定量。样品中各游离脂肪酸含量计算公式：

式中：ci：样品中游离脂肪酸i的含量（mg/L）；Ai：样品中游离脂肪酸i的峰面积；As：样品中内标的峰面积；fsi：相对质量校正因子；cs：样品中内标物的含量（mg/L）。

2　结果与分析

2.1萃取溶剂的选择

常用的脂类萃取溶剂有乙醚-石油醚[7，18]、正己烷-二氯甲烷[16]、氯仿-甲醇[19]。本研究参照相关研究选定四种溶剂组合：正己烷-二氯甲烷（2∶1，v/v）、乙醚-石油醚（1∶1，v/v）、乙醚-正己烷（1∶1，v/v）、氯仿-甲醇（2∶1，v/v），比较其对游离己酸、辛酸和癸酸的提取效果。结果发现，正己烷-二氯甲烷和氯仿-甲醇溶剂组合对羊奶中这三种游离脂肪酸的提取效果较好（见图1）。正己烷-二氯甲烷在萃取过程容易乳化，分层不明显，使得平行组之间偏差较大，氯仿-甲醇能提取出结合态脂类，对游离己酸的提取效率高，萃取过程不易乳化[20]，因此选择氯仿-甲醇（2∶1，v/v）为萃取溶剂。

图1　不同萃取溶剂的提取效果Fig.1　Extraction efficiency of different solvents

2.2脂肪酸甲酯萃取过程有机溶剂的选择

脂肪酸甲酯常用的萃取溶剂有正己烷、氯仿，本研究比较了这两种溶剂对所测脂肪酸甲酯的提取效果。正己烷、氯仿对这三种脂肪酸甲酯的提取效果差异不明显，但是氯仿组在色谱测定时溶剂有拖尾现象（见图2），这可能和氯仿具有一定能力的吸水性相关，水分还会对实验所用色谱柱有一定的损害作用。因此，选定正己烷（色谱级）作为萃取脂肪酸甲酯的有机溶剂。

2.3方法的专属性

羊奶样品与标准品溶液脂肪酸甲酯的保留时间一致，各脂肪酸甲酯的分离效果良好，虽然己酸甲酯主峰前后有色谱峰出现，但与主峰能实现基线分离，羊奶样品中的内源性物质及其它杂质不干扰样品的分离测定。该方法在羊奶样品中还能检测到另外9种游离脂肪酸（见图3）。

表1　线性关系和检出限分析Table 1　Linear relationship and detection limit of the three kinds of free fatty acids

图2　正己烷（A）和氯仿（B）萃取脂肪酸甲酯色谱图Fig.2　Chromatograms of FAMEs extracted by hexane（A）and chloroform（B）

2.4线性关系及检出限

取配好的混和标准品稀释液，由低向高浓度连续进样。以分析物的浓度为横坐标，峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，进行线性回归。

取混和标准品稀释液（标号1）分别进行系列梯度稀释测定，以信噪比（S/N）为3时标准品的浓度计算检出限，信噪比（S/N）为10时标准品的浓度计算定量限。

在测定浓度围内，FID响应值与被测组分的线性关系良好，决定系数均在0.998以上；三种游离脂肪酸的检出限和定量限分别在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范围内（见表1）。

2.5回收率

空白奶样分别加入三个不同浓度的己酸、辛酸、癸酸标准品溶液（加标量见表2），每个浓度做3个平行，同时做6个空白奶样（标号1#、2#、3#、4#、5#、6#）。按确定方法进行处理、测定。根据实际加标量和测定加标量计算回收率。

图3　标准品溶液（A）和奶样（B）的色谱图Fig.3　Chromatograms of standards（A）and goat milk（B）

己酸的平均回收率为88.5%，RSD＜5.00%；辛酸的平均回收率为91.9%，RSD＜6.00%；癸酸的平均回收率为103.4%，RSD＜6.50%，表明在所选择的方法和条件下，三种游离脂肪酸在所选加标浓度下均有较高且稳定的回收率（见表2）。

表2　回收率实验结果Table 2　Recovery of the three kinds of free fatty acids

2.6方法重复性

表3　重复性实验Table 3　Repeatability of the three kinds of free fatty acids

按确定方法处理测定6个平行空白奶样（1#、2#、3#、4#、5#、6#），计算各游离脂肪酸浓度的相对标准偏差。己酸、辛酸浓度的RSD＜5.00%，癸酸浓度的RSD＜7.00%，表明该方法重复性较好（见表3）。

2.7日内日间精密度

取高中低3种浓度的混和标准品稀释液（混标液2、6、10），在1d内连续进样6次。连续测定5d，计算峰面积的相对标准偏差。各峰面积日内RSD＜5.00%，日间RSD＜6.00%，表明建立的气相色谱分析方法稳定可靠（见表4）。2.8脂肪酸衍生产物（脂肪酸甲酯）溶液稳定性

表4　精密度分析Table 4　Precision of intra-day and inter-day assay

将一份奶样按确定方法制备好后（奶样5#），在常温下0、4、8、12h进样测定，然后-40℃下保存，1～5d内每天测定一次，根据各脂肪酸甲酯对应的峰面积变化评价其稳定性。各脂肪酸甲酯的日内RSD及日间RSD均小于10%，表明所测各游离脂肪酸预处理后的衍生产物（脂肪酸甲酯）样品在常温下保存12h，-40℃下密封保存5d仍保持稳定，均未发生明显的变化（见表5）。

2.9样品测定

采用本方法对羊奶和单菌种在相同发酵条件下制得的酸羊奶共6个样品进行检测。结果表明，发酵后的羊奶中，游离己酸、辛酸、癸酸明显增加，这和Guler Z，Regula A等的研究相符[7，9]，但各乳酸菌发酵后的酸羊奶膻味均有不同程度的减弱，可能是发酵过程产生的乙醛、双乙酰（丁二酮）等有益风味物质对膻味起了一定的掩蔽作用。另外，不同乳酸菌对三种游离脂肪酸含量的影响存在差异（见表6）。

3　结论

本实验建立了测定羊奶中游离己酸、辛酸、癸酸的多级溶剂萃取-气相色谱方法。该方法对分析与羊奶中与膻味密切相关的游离己酸、辛酸、癸酸的专属性好，检出限和定量限分别在0.16～0.25mg/L和0.54～0.83mg/L范围内，重复性好（RSD均小于10%），回收率在88.5%～103.4%范围，适用于对液态奶产品中这三种游离脂肪酸的分析。本方法还检测到其他9种游离脂肪酸，但对这些脂肪酸的定量检测适用性还待进一步研究。

表6　样品中游离脂肪酸检测结果Table 6　Determination results of the FFAs in the samples

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Determination of the free fatty acids responsible for goaty flavor using multilevel solvent extraction-gas chromatography

YANG Chun-jie，DING Wu*，MA Li-jie
（College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University，Yangling 712100，China）

Objective：A method for the simultaneous determination of the free fatty acids（FFA）in goat milk such as caproic acid，caprylic acid and decanoic acid，which were responsible for goaty flavor，was developed by multilevel solvent extraction-gas chromatography.Methods：Extractions were carried out with chloroform/ methanol（2∶1，v/v）and sodium carbonate solution.The fatty acid methyl esters（FAMEs）which were obtained by the esterification of the FFA with boron trifluoride-methanol solution was qualified and quantified by gas chromatography equipped with flame ionization detector.Results：Over the concentration in the range of 5.11～163.52mg/L for caproic acid，5.05～161.73mg/L for caprylic acid and 7.54～241.38mg/L for decanoic acid，the coefficients of the calibration curves were above 0.998.The limits of detection（LOD）were 0.16mg/L for caproic acid，0.19mg/L for caprylic acid and 0.25mg/L for decanoic acid.The limits of quantification（LOQ）were 0.54mg/L for caproic acid，0.63mg/L for caprylic acid and 0.83mg/L for decanoic acid.The average recoveries of the three kinds of FFA ranged from 88.5%to 103.4%with relative standard deviations（RSDs）between 1.98%and 6.09%.Conclusion：The method was economical，accurate，and sensitive，which may be used for determination of the FFAs in milk.

solvent extraction；methylation；gas chromatography；free fatty acid；goat milk

TS252.7

A

1002-0306（2014）14-0068-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.005

2013－10－09*通讯联系人

杨春杰（1985-），男，硕士研究生，研究方向：畜产品加工和食品安全。

国家公益性行业（农业）科研专项经费项目（3-45）。