加压毛细管电色谱测定糕点中富马酸二甲酯

郭启雷，潘红艳，史海良，杨红梅，王 浩（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

加压毛细管电色谱测定糕点中富马酸二甲酯

郭启雷，潘红艳，史海良，杨红梅，王 浩
（国家食品质量安全监督检验中心，北京100094）

建立了利用加压毛细管电色谱（pCEC）测定糕点中富马酸二甲酯（DMF）的分析方法。样品采用甲醇超声提取，提取液经反相毛细管电色谱柱分离，流动相乙腈-水（3∶7，v/v），泵流速0.05mL/min，分离电压-5kV，紫外检测器检测。该方法在2.0～100mg/kg质量浓度范围内线性关系良好（r2=0.9998），定量限为20mg/kg，加标回收率为85.5%～93.6%，相对标准偏差小于5%。该方法操作简单、快速，准确可靠，为糕点中富马酸二甲酯的检测提供了新的技术手段。

加压毛细管电色谱，糕点，富马酸二甲酯

富马酸二甲酯（Dimethyl Fumarate，DMF）为白色晶体，易溶于乙酸乙酯、氯仿、丙酮、乙腈和醇类[1]。DMF是二十世纪八十年代开发的广谱高效防腐剂，对近40种真菌和细菌有较高的抑杀活性[2-3]，与苯甲酸、山梨酸和丙酸钙不同，其抑菌活性受pH影响小，在pH3.0～8.0范围内对各种霉菌均有良好的抑制作用，曾用于食品、饲料、日用工业品的防霉防腐及水果保鲜[1，4]。但近年来的研究表明，DMF被人体皮肤吸收，会引起发痒、发红和灼伤等症状，DMF经消化道进入人体，会引起咽喉肿痛、腹痛等症状，此外，DMF进入人体会分解为富马酸和有毒物质甲醇，长期食用对肝、肾有很大的副作用，尤其是对儿童的成长发育危害很大[1-2]。因此，2009年2月，卫生部将DMF列入第二批食品中可能违法添加的非食用物质名单中，明确DMF不得作为食品添加剂使用。但是，由于其防霉效果好且抑菌活性受pH影响小，一些不法经营者受经济利益驱动，仍违法将DMF用于食品的防腐。因此建立食品中DMF的简单、快速、准确的测定方法非常必要。目前，文献报道关于食品中DMF的检测方法主要有液相色谱法（HPLC）[5-7]、气相色谱法（GC）[8]、气相色谱—质谱联用法（GC-MS）[9]。

毛细管电色谱（Capillary Electro-Chromatography，CEC）是将毛细管柱内填充或键合固定相，以电渗流为驱动力，结合了微径高效液相色谱与毛细管电泳两者的特点，具有高柱效、快速分离、高选择性、高精度以及试剂和样品用量少等优点，但单纯的CEC模式易产生气泡、干柱等问题[10]。而加压毛细管电色谱（Pressurized Capillary Electro-Chromatography，pCEC）通过微型液相色谱泵在毛细管电色谱柱一端施加压力，压力的引入使CEC分离过程受pH和缓冲液的限制相对减少，可有效地解决CEC的气泡问题，且能实现梯度洗脱；用电渗流和泵压同时驱动流动相，溶质依据它们在流动相与固定相中分配系数的不同和自身电泳淌度的差异得到分离，对复杂样品显示出极大的分离能力[11]。pCEC技术近年来开始应用于食品安全领域[11-14]，本研究建立了应用pCEC分析糕点中富马酸二甲酯的新方法，操作简单、快速，准确可靠，为食品中非食用物质检测提供了新的解决方案。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、乙腈 美国Fisher公司，色谱纯；富马酸二甲酯（99.0%） 德国Dr.Ehrenstorfer公司。

加压毛细管电色谱仪 TriSepTM-2100（Unimicro Technologies，Inc.，Pleasanton，CA，USA），包括2台高压输液泵、±30kV高压电源、微流控制系统、紫外检测器和数据处理系统；Milli-Q纯水系统 美国Millipore公司；电子天平（感量0.0001g、0.01g） 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；HY-5回旋振荡器 国华电器有限公司；超声波清洗器KQ5200 昆山市超声仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 pCEC条件 毛细管电色谱柱EP-100-20/45-3-C18（苏州环球色谱有限公司），内径100μm，有效柱长20cm，总长45cm，填料为粒径3μm ODS，流动相：乙腈∶水=30∶70，流速：0.05mL/min，检测波长220nm，电压-5kV。

1.2.2 标准曲线的制备 准确称取0.1g（精确至0.0001g）富马酸二甲酯标准品，用甲醇溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，配制成1.00mg/mL的标准储备液。然后用甲醇逐级稀释成2.00、5.00、10.0、20.0、50.0、100.0μg/mL系列浓度标准工作溶液，经0.22μm有机相滤膜过滤后进加压毛细管电色谱仪测定，峰面积对浓度作图。

1.2.3 样品处理 称取粉碎样品5g（精确至0.01g）于50mL具塞三角烧瓶中，加入30mL甲醇，超声提取10min，上清液收集到50mL容量瓶中，残渣加入甲醇15mL，振荡提取15min，合并提取液于50mL容量瓶中，甲醇清洗残渣并定容至刻度，混匀后取提取液过0.22μm有机相滤膜，供pCEC测定。

2 结果与讨论

2.1 流动相中有机相条件的优化

实验考察了流动相中有机相的组成和比例对DMF色谱分离的影响，发现甲醇-水系统、乙腈-水系统均能得到很好的分离效果，其中后者的柱压较低，故采用乙腈-水系统作为流动相。如图1所示，随着流动相中乙腈比例增加，DMF的保留时间越来越短，分析速度加快，同时色谱峰的峰宽越来越小，综合考虑色谱分离的周期和实际样品基质的复杂性，最后选择流动相为乙腈∶水（3∶7，v/v）的实验条件进行色谱分离。

图1 流动相中有机相比例对pCEC分离DMF的影响Fig.1 Effect of the concentration of acetonitrile in mobile phase on the pCEC separation of DMF

2.2 施加电压的研究

实验考察了施加不同的电压对DMF色谱行为的影响。从图2中可以看出，施加正电压可以使DMF的保留时间延长，正电压越高，保留时间越长，但同时峰形变差，色谱峰展宽同时开始拖尾。而施加负电压则正好相反，负电压越大，保留时间越短，峰宽越小，同时色谱死时间也在缩短。综合考虑分离度和分析时间，选择-5kV为分析条件。

文献多采用含有四丁基溴化铵的缓冲溶液作为流动相中的水相，系统配制复杂，本实验建立的以pCEC为分析平台，在-5kV的电压下，以乙腈∶水（3∶7，v/v）为流动相，实现了样品中DMF的良好分离。同时，对于阳性样品，可以通过在-20～+10kV范围内改变电压，观察样品峰与标准品色谱峰的保留时间符合程度来进一步判断样品中是否含有DMF，相较普通液相色谱来说，增加了定性的准确性。

图2 DMF在不同电压下的pCEC色谱图Fig.2 Effect of applied voltage on the pCEC separation of DMF

2.3 提取条件的选择

DMF易溶于乙酸乙酯和醇类溶剂，所以文献中常用乙酸乙酯和甲醇作为提取溶剂，其中气质联用法常用乙酸乙酯[8-9，15]，液相色谱法常采用甲醇[1，5，16]。本文基于液相色谱的基本原理，选用甲醇作为提取溶剂，取得了良好的结果，空白样品和样品加标色谱图见图3。对于pCEC来说，被分析组分的迁移速度取决于三个方面，一是电渗流速率，由于-5kV的电压是加载在出口端，带正电的电渗流方向是从色谱柱的入口端到出口端；二是电泳速率，在外加电场作用下，各分析组分根据各自所带电荷的不同、自身分子的大小等因素而具有不同的电泳方向和速率；三是微型液相色谱泵提供的流动相流速。在三个驱动力的综合作用下，DMF与食品的基质成分得到了很好分离，从图3可以看出，本实验建立的仪器条件和前处理方法对DMF的测定没有干扰，确保了定性、定量的准确性。

图3 不同样品的空白基质和基质加标pCEC色谱图Fig.3 pCEC chromatograms of blank sample and spiked sample with DMF

2.4 检出限、线性范围和回收率

在空白样品中添加一定浓度的标准工作溶液，按照上述实验方法进行处理，用pCEC测定，以10倍信噪比计算本方法的定量限为20mg/kg。按照1.2.2制备系列浓度标准工作溶液，按浓度由低到高依次经加压毛细管电色谱仪测定，峰面积对浓度作图，得到DMF的线性方程A=126.83C+3.90，r2=0.9998，线性范围2～100mg/kg。采用经测定不含有DMF的3种样品，进行添加回收和精密度实验，加标浓度为20、50、100mg/kg，按本文实验方法进行处理，用pCEC进样测定。平均添加回收率（每个添加浓度平行测定5次）为85.5%～93.6%，相对标准偏差小于5%，结果见表1。采用本方法对市场上的30例糕点样品进行检测，均未发现阳性样品，表明目前对富马酸二甲酯的滥用得到了有效控制。

表1 3种样品中DMF的回收率和精密度Table 1 Recovery and repeatability of DMF

3 结论

以非食用物质富马酸二甲酯（DMF）为研究对象，选取糕点食品基质，样品采用甲醇超声提取，提取液采用反相毛细管电色谱柱分离，泵流速0.05mL/min，分离电压-5kV，流动相乙腈∶水（3∶7，v/v）等度洗脱。该方法在2～100mg/kg质量浓度范围内呈线性关系（r2=0.9998），定量限为20mg/kg，加标回收率为85.5%～93.6%，相对标准偏差小于5%。目前文献中液相色谱法的流动相配制较为复杂[6-7]，水相采用乙酸钠、四丁基溴化铵缓冲液配制，冰乙酸调节pH，有机相选用甲醇或乙腈。本文采用简单的流动相组成（乙腈-水系统），就实现了DMF与基质成分的良好分离，同时与高效液相色谱和超高效液相色谱相比，pCEC采用0.05mL/min的流速极大地减少了有机溶剂的使用，经济、环保。另外，相较普通高效液相色谱来说，pCEC可以通过施加不同的电压进一步判断样品中是否含有DMF，在不采用GC-MS等昂贵仪器设备的情况下，同样可以增加定性的准确性。该方法操作简单、快速，准确可靠，为糕点中富马酸二甲酯的检测提供了新的技术手段。

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Determination of dimethyl fumarate in pastry by pressurized capillary electro-chromatography

GUO Qi-lei，PAN Hong-yan，SHI Hai-liang，YANG Hong-mei，WANG Hao
（National Food Quality＆Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

An effective and convenient method for determination of dimethyl fumarate（DMF）in pastry by pressurized capillary electro-chromatography（pCEC）with ultra-violet detection was developed.The samples were extracted with methanol.The separation was performed on a reversed phase C18column in an isocratic mode with 220nm as the UV detection wavelength.The effects of ratio of organic phase and separation voltage on separation efficiency were optimized.The mobile phase was composed of acetonitrile and water（3∶7，v/v），at a pump flow rate of 0.05mL/min.Under the optimal conditions，the linear range of DMF was 2.0～100mg/kg with correlation coefficient higher than 0.9998.The mean recoveries were 85.5%～93.6%and the relative standard deviations（RSD）were less than 5%.

pressurized capillary electro-chromatography；pastry；dimethyl fumarate

TS207.3

A

1002-0306（2014）14-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.14.006

2013-11-11

郭启雷（1979-），男，博士，研究员，研究方向：食品安全。

北京市科技计划项目（Z111100056811006）。