体外受精—胚胎移植中不同授精浓度对胚胎质量及妊娠结局的影响

（中国医科大学附属盛京医院妇产科辅助生殖中心，沈阳110004）

体外受精—胚胎移植中不同授精浓度对胚胎质量及妊娠结局的影响

杨大磊，潘伯臣，何丽霞，王秀霞，王天任，李正涛

（中国医科大学附属盛京医院妇产科辅助生殖中心，沈阳110004）

目的通过比较不同授精浓度下胚胎发育及妊娠结局，探讨体外受精—胚胎移植（IVF-ET）中较为合适的授精浓度。方法对因输卵管因素接受IVF-ET的夫妇进行随机对照试验，根据不同授精浓度随机分为3组：A组为（0.1～0.5）×106/mL，B组为（0.5～1.0）×106/mL，C组为（1.0～1.5）×106/mL。比较3组间正常受精率、多精受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率、着床率及流产率。结果3组的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率及流产率均无统计学差异（P＞0.05），但B组和C组的多精受精率（分别为14.9%和13.2%）明显高于A组（8.6%）（P＜0.05），而且C组的妊娠率及种植率（50.0%，29.5%）明显高于B组（41.4%，20.4%）和A组（38.6%，18.8%）（P＜0.05）。结论IVF-ET治疗中，增加授精滴中精子浓度可导致卵子多精受精增加，但在一定范围内增加精子浓度可能改善妊娠结局。

体外受精—胚胎移植；精子浓度；授精；多精受精；妊娠率

1978年世界首例试管婴儿诞生以来人类辅助生殖技术发展近35年，获得满意的体外受精—胚胎移植（in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET）治疗结局是所有学者所共同追求的目标。很多因素可以影响IVF-ET的治疗结局，如患者本身的生理条件、临床用药方案、实验室技术及设备等等。其中精子—卵子体外共同孵育即授精是IVF-ET治疗过程重要环节之一，得到了国内外学者的关注。授精时的精子浓度有可能影响胚胎的发育及妊娠的结局。本文旨在通过前瞻性分析不同精子浓度对受精、胚胎发育及妊娠结局的影响，来探讨IVF-ET治疗过程中授精时合适的授精浓度。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2012年1月至2012年6月在中国医科大学附属盛京医院辅助生殖中心因输卵管梗阻因素不孕行常规IVF-ET治疗的患者，共210例。患者平均年龄（31.9±5.2）岁，不孕年限（4.3±2.8）年，平均取卵数（9.3±5.7）个，共获卵1 957枚。男方精液检验指标均在正常范围。

1.2方法

1.2.1 临床治疗：所有患者均接受常规的IVF-ET治疗。女方采用常规超促排卵方案，人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）注射后36 h在B超引导下经阴道取卵，卵子经孵育2～4 h后进行授精。

1.2.2 授精：将充分液化的精液采用梯度离心加上游法进行处理，并吸取上层的精子悬液在Quinn′s 1020培养液中进行稀释调节。授精采用微滴法，卵裂期及移植用培养液分别为Quinn′s 1026及Quinn′s 1029，Thermo单气培养箱，5%CO2。微滴为100 μL，平均每滴放置2枚卵子，16～18 h后观察受精情况。

1.2.3 分组：授精液用Makler精子计数板进行计数［1］。取少许授精液，65℃水浴灭活5 min，然后计数100个小方格，计数总数×105/mL即为精子的密度。将患者随机分A、B、C 3组。A组体外授精时，调整精子授精浓度为（0.1～0.5）×106/mL，即每滴授精液中含1万～5万条精子；B组精子授精浓度为（0.5～1.0）×106/mL，即每滴授精液中含5万～10万条精子；C组精子授精浓度为（1.0～1.5）×106/mL，即每滴授精液中含10万～15万条精子。每组均为70例患者（周期），获卵数分别为653枚、656枚、648枚。

1.2.4 胚胎评分：采用ASEBIR评分系统［2］，D3胚胎，7～8个细胞且大小均匀、碎片＜10%、无液泡、透明带正常者为优质胚胎。

1.2.5 妊娠结局：移植后14 d，测血HCG值阳性且35 d后B超观察到宫腔内胎囊及胎心，则确认临床妊娠。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 患者临床特征的组间比较

3组患者之间女方年龄、不孕年限、平均移植胚胎数及男方的精液参数包括精子密度、精子活动率及精子正常形态百分率均无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 患者临床特征的组间比较Tab.1 Comparison of clinical characteristics among the three groups

2.2 患者IVF-ET治疗结局的组间比较

A、B和C组之间在受精率、卵裂率、优质胚胎率及流产率均无显著差异（P＞0.05），但多精受精率、临床妊娠率和着床率的差异显著。其中B、C两组多精受精率明显高于A组（P＜0.05），但B、C两组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。C组妊娠率明显高于A组和B组（P＜0.05），但A组和B组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。C组胚胎着床率明显高于A组和B组（P＜0.05），但A组和B组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 IVF⁃ET治疗的实验室及临床结局Tab.2 Laboratory and clinical outcomes of IVF⁃ET treatment

3 讨论

有研究发现，卵子长时间与高浓度的精子在微滴中共同孵育时，精子产生的水解酶和自由基可对卵子造成损害［3，4］，而缩短精卵共同孵育时间可以改善胚胎发育及提高妊娠率［5］，高浓度精子可以导致

多精受精的发生［6，7］。这些结果提示，如果授精液中精子数量过多，其代谢产物会对卵子、胚胎乃至妊娠结局产生较大影响，因此有学者提出应尽可能降低授精液中的精子浓度及作用时间。但也有学者提出相反的观点，认为精子浓度与多精受精无相关性［8］，而且缩短精子对卵子的作用时间非但不能改善胚胎的形态及妊娠的结局，反而可以降低正常受精率［9］。可见，有关体外授时适宜的精子浓度和作用时间等问题尚存争议。最近，有学者用山羊配子做研究，将孵育时间（范围2～28 h）与精子浓度［（0.5～4）×106/mL］综合分析，提出在孵育时间为12～14 h、精子浓度4×106/mL时可达到最佳的穿透能力及得到优质的胚胎。此外，该实验还考虑了精子的其他参数和卵丘卵母细胞复合体等可能的影响因素［10］。也就是说，决定授精效果的因素很多，包括精子的浓度和精卵作用时间，甚至还包括授精滴的体积、动物物种和其他培养条件。因此，在评价体外授精效果时，应该结合具体的实验条件或排除干扰因素后进行分析探讨。

本研究采用过夜培养的方法，在固定精卵孵育时间的条件下着重分析人类辅助生殖技术IVF-ET过程中不同授精浓度对胚胎发展及妊娠结局的影响。为了排除患者自身病情因素对实验室和临床妊娠结局可能带来的影响，我们选择单纯输卵管性不孕的女性患者，同时选择精液常规分析精子各项参数均在正常范围的男性。而且随机分组后，3组之间除授精精子浓度外，女方年龄、不孕年限、平均取卵数、平均移植数和男方精子常规分析参数均无显著差异（P＞0.05），具有可比性。结果显示，3组间的正常受精率、卵裂率、优质胚胎率无统计学差异（P＞0.05），说明在精子浓度达到一定程度后，在此范围内增加或降低精子的浓度并不会影响精子的正常受精率和卵裂率，也不会影响胚胎的形态。但是，随着授精精子浓度的增加，多精受精率明显增高，C组多精受精率已接近A组的1倍，且精子浓度与多精受精率之间存在量效关系，提示增加精子的浓度可能会导致异常受精率的增加，与上述部分研究的结果一致［6，7］。然而从临床结局看，3组之间虽然流产率没有显著性差异（P＞0.05），但C组的妊娠率和着床率却明显高于A、B两组（P＜0.05）。而且精子浓度与妊娠率和着床率之间存在量效关系，说明在一定范围内增加精子浓度有可能改善妊娠结局。我们的结果与之前的研究结果［11］不一致的可能原因是因为我们设计的最高授精浓度为15万/滴（相当于1.5×106/mL，精/卵比例75 000∶1），此浓度下精子产生的代谢产物仍不足以影响胚胎的发展，而一定程度上高浓度的精子反而给予卵子更多的选择与质量优良的精子结合，产生更优质的胚胎（尽管在光学显微镜下从形态上无法观察到），因而产生更好的临床结局。虽然在自然受孕的过程中真正到达卵子周围的精子仅有数十条，但那是在女性生殖道中通过层层的生理屏障优选出的最优质的精子。而在体外授精过程中，我们无法模拟更多的生理优选精子的方式，只能通过适当提高精子的浓度，让精卵自然选择，优胜劣汰。此时，提高精子浓度也就意味着更多产生优质胚胎的机会。人们普遍担心培养液中精子数量较多时其产生的活性氧会对卵子造成伤害，但近期的研究表明，适量的活性氧对精子的获能、活化和顶体反应是必须的［12］。因此，应该寻找和维持授精液中适当的精子浓度，而不是精子浓度越低越好。本研究中高浓度精子组临床结局较好的原因或许与此有关。

总之，本研究既证实了培养体系中多精受精率随精子浓度增高而增高，也发现了高精子浓度组临床结局较好的现象。如何权衡好本研究结果带来的利与弊，做出更合理的选择，是我们今后应该考虑的问题。同时需要指出，迄今为止有关人卵体外受精中最适精子浓度的专门研究报道较少，尚无统一规范。国外文献显示，较常使用的精子浓度为0.15×106/mL左右［13］，但也有高达（4～10）×106/mL［5］，本研究设计精子浓度在此之间。本研究是在我院生殖中心实验条件下的初步探索，其意义在于揭示一种有别于先前观点的实验现象，而不在于推广某种实验方法，因为各生殖中心的实验条件各异。同时，本研究结果与结论仍待今后更大样本量的实验研究证实。

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（编辑陈姜）

EffectofDifferentSperm Insemination Concentrationson Embryo Quality and Pregnancy Outcome in IVF-ET

YANG Da-lei，PANBo-chen，HE Li-xia，WANGXiu-xia，WANGTian-ren，LIZheng-tao
（CenterforAssisted Reproduction，DepartmentofObstetrics and Gynecology，Shengjing Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo explore the optimal sperm insemination concentration for the in vitro fertilization-embryo transfer（IVF-ET）procedure through comparison of the outcomes of IVF-ET with different sperm insemination concentrations.MethodsA randomized controlled trial was carried out in 210 couples who received IVF-ET treatment for tubal factor infertility.Couples were randomly divided into three groups according to the insemination concentrations：group A with concentration（0.1-0.5）×106/mL，group B（0.5-1.0）×106/mL，and group C（1.0-1.5）×106/mL.Normal fertilization rate，polyspermy rate，cleavage rate，high-quality embryo rate，pregnancy rate，implantation rate and abortion rate were compared between the three groups.ResultsNo significantdifference wasfound in normalfertilization rate，cleavage rate，high-quality embryo rate and abortion rate between the three groups（P＞0.05）.However，the polyspermy rates of group B（14.9%）and group C（13.2%）were significantly higher than that of group A（8.6%）（P＜0.05）.In addition，the pregnancy rate（50.0%）and implantation rate（29.5%）of group C were significantly higher than those ofgroup B（41.4%and 20.4%）and group A（38.6%and 18.8%），respectively（P＜0.05）.ConclusionIncreasing the sperm concentration ofinsemination in the culture dropletin IVF-ET treatmentmay increase the risk ofpolyspermy fertilization.However，increasing the sperm insemination concentration within a certain scope may improve the treatmentoutcome.

in vitro fertilization-embryo transfer；sperm concentration；insemination；polyspermy；pregnancy rate

R321-33

A

0258-4646（2014）01-0067-04

辽宁省教育厅高校科研计划（LT2010106）

杨大磊（1981-），男，技师，本科.

潘伯臣，E-mail：panpancmu@yahoo.com.cn

2013-11-20

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