补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞PI3K/AKT信号转导通路影响的实验研究

刘亚莉，易佳丽，王莹，井欢，刘春英

（1.辽宁中医药大学基础医学院病理学教研室，沈阳110032：2.辽宁卫生职业技术学院医学技术系卫生检验教研室，沈阳110101）

补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞PI3K/AKT信号转导通路影响的实验研究

刘亚莉1，2，易佳丽1，王莹1，井欢1，刘春英1

（1.辽宁中医药大学基础医学院病理学教研室，沈阳110032：2.辽宁卫生职业技术学院医学技术系卫生检验教研室，沈阳110101）

目的观察补中益气汤含药血清对肺腺癌顺铂耐药细胞A549/DDP的抑制作用，并探讨其对磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）蛋白和mRNA表达的影响。方法以SD大鼠制备高、中、低剂量的补中益气汤含药血清和空白对照血清。MTT法筛选最佳含药血清组。培养细胞分为空白血清组、最佳含药血清组、LY294002组（阻滞剂组）、最佳含药血清+ LY294002组（联合组）和阴性对照组。免疫细胞化学方法和实时荧光定量PCR（RT-PCR）方法检测PI3K、p-AKT蛋白和mRNA的表达情况。结果随着含药血清浓度的升高，对顺铂的逆转倍数不断增加；中剂量含药血清作用48 h为最佳含药血清及最佳作用时间；最佳含药血清可使A549/DDP细胞中PI3K、p-AKT蛋白表达减少，与空白血清组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；补中益气汤诱导A549/DDP细胞PI3K、p-AKT mRNA表达显著减少，与空白血清组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），与阻滞剂联合作用p-AKT mRNA下降更为明显。结论补中益气汤可通过降低A549/DDP细胞中PI3K、p-AKT mRNA的表达而影响PI3K/AKT信号转导通路，进而发挥对顺铂耐药的增敏作用。

补中益气汤；磷脂酰肌醇3激酶；磷酸化蛋白激酶

随着我国城镇化进程的加快和空气污染、吸烟人群的增多，肺癌的发病率和死亡率有明显增多的趋势。研究表明，肺癌的发生与癌基因表达增高、抑癌基因表达减弱、细胞凋亡减弱等均有关。其中磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信号转导通路是影响细胞凋亡的诸多因素激发胞内信号的

汇聚点，在肿瘤细胞的凋亡调控中起重要作用。目前，肺癌患者治疗主要采用外科手术、放疗和化疗，但患者易出现头晕目眩，面色萎黄，气短乏力，舌淡脉弱、纳差便溏等脾胃虚弱，气血亏虚的表现，严重影响患者的生存质量。既往研究表明培土生金中药能提高机体免疫力，增强化疗药物的作用，减轻化疗引起的不良反应及提高患者的生存质量［1］。但只限于患者临床症状的改善上，尚未涉及蛋白及基因水平研究。本研究拟通过血清药理学方法从补中益气汤对PI3K/AKT蛋白和mRNA表达的角度探讨其抑瘤及改善患者症状的分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物和细胞

SD大鼠40只购于辽宁中医药大学实验动物中心，体质量（200±10）g，动物许可证号：辽实动质（字）（2012-0012号）。A549、A549/DDP细胞株购于中国医科院肿瘤研究中心细胞库。

1.2 药材及主要试剂

补中益气汤全部药材购于辽宁中医药大学药房，经辽宁中医药大学药理实验室鉴定后，按《动物与人体的每千克体重剂量折算系数表》［2］计算大鼠的等效用药剂量，根据临床成人用药剂量的2、1、1/2倍分别设补中益气汤高、中、低剂量组，常规煎煮，过滤，水浴蒸发至每毫升含生药2.626 g、1.313 g、0.657 g，冷却后4℃保存。顺铂购自齐鲁制药厂；DMEM细胞培养液、胎牛血清、025%胰蛋白酶购于Hyclone公司；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium；MTT）试剂盒购自北京鼎国生物技术有限公司；美国PI3K、AKT抗体购于南京凯基生物技术有限公司。Triozol Reagent购于美国Invitrogen Life technologies公司；PI3K、AKT荧光定量PCR（real time PCR；RT-PCR）试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司；引物合成由北京华大基因公司提供。

1.3 补中益气汤含药血清的制备

SD大鼠40只随机分为补中益气汤高、中、低剂量组和空白血清4组，每组10只，分别灌服补中益气汤高、中、低剂量和生理盐水1 mL/d，连续3 d，末次灌胃1 h后，腹主动脉采血，2 000 r/min，离心5 min，取上清，56℃水浴箱30 min灭活，0.22 μm微孔滤过除菌，-20℃冰箱保存备用。

1.4 MTT法检测各组A549/DDP细胞对顺铂的敏感性

取对数生长期的A549/DDP制成单细胞悬液105/mL，接种于96孔板中，细胞贴壁后，分组为：空白血清组，空白血清+顺铂组，含药血清高剂量+顺铂组，含药血中剂量清+顺铂组，含药血清低剂量+顺铂组，顺铂终浓度为6、12、25、50、100、200、400 μmol/L，终体积为200 μL，分别加入受试物，每组设4个复孔，设调零孔，继续培养48 h，加入5 mg/mL的MTT 20 μL作用4 h，弃上清，加入二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）150 μL，置摇床混匀10 min，酶标仪在波长570 nm处测每孔的光密度（A值），取平均值。根据公式计算细胞抑制率（IR）=［1-（实验组A均值-调零孔A均值）/（空白血清组A均值-调零孔A均值）×100%，用SPSS 17.0软件计算出各组的半数抑制率（the half maximal inhibitory concentration，IC50），以及逆转倍数（reversal index，RI），RI=药物IC50（不加逆转剂）/药物IC50（加逆转剂）。以上实验重复3次。

1.5 最佳含药血清筛选

培养A549/DDP细胞，取生长状态良好，处于对数生长期的细胞随机分为：（1）空白血清组，用含10%空白血清组的大鼠血清的DMEM培养基培养，不加任何药物；（2）含药血清高剂量组；（3）含药血清中剂量组；（4）含药血清低剂量组。（2）～（4）组分别加含10%的补中益气汤高、中、低剂量组大鼠血清的DMEM培养基，各组细胞在处理12 h、24 h、48 h、72 h后，分别加5 mg/mL的MTT 20 μL作用4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，震荡10 min，酶标仪测定各孔的吸光度（optical density，OD570），各时段均设不加细胞只加培养液的空白调零孔。每组5个平行样本，重复3次取平均值。计算含药血清的抑制率。

1.6 免疫细胞化学方法检测PI3K、AKT蛋白表达

培养A549/DDP细胞待贴壁进入对数生长期后随机分为4组：空白血清组、最佳含药血清组、LY294002组（以下简称阻滞剂组）、LY294002+最佳含药血清组（以下简称联合组），阴性对照组（PBS代替一抗作用）。各组分别加入含10%SD大鼠空白血清、10%最佳含药血清、含LY294002 1 μL的10%SD大鼠空白血清和含LY294002 1 μL的10%最佳含药血清。阴性对照组正常培养。培养48 h后，4%多聚甲醛固定，3%H2O2孵育20 min，10%山羊血清封闭30 min，一抗孵育，阴性对照组以PBS代替一抗，4℃过夜，加二抗作用30 min，3，3二氨基联苯胺（diaminobenzidine；DAB）显色，苏木素复染，封片。采用Image Pro Plus医学图像分析系统进行图像分析，在

400倍高倍镜下，随机取5个视野，每个视野为2 592×1 944像素点，分别测出阳性反应细胞的总面积和分光光密度，求出平均光密度（average optical density，AOD）。

1.7 RT-PCR方法检测各组细胞中PI3K、AKT mRNA的表达

干预因素处理48 h后，收集各组细胞。PCR引物采用Primer Premier 5.0软件设计引物序列，GAPDH：5′-CAATGACCCCTTCATTGACC-3′，5′-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3′，135 bp；PI3k：5′-CCGAGACACTGCTGATG-3′，5′-GGTATTTGGACACTG GGTA-3′，254 bp；AKT：5′-CTCATTCCAGACCCAC GAC-3′，5′-CAGCCCGAAGTCCGTTA-3′，241 bp。采用Trizol试剂提取细胞总RNA，检验样本中RNA纯度，计算RNA浓度（μg/μL）＝OD260×40×稀释倍数/ 1 000。按逆转录试剂盒说明逆转录合成cDNA，反应条件为37℃15 min，85℃5 s共1个循环。PCR扩增的反应条件为95℃0.5 min，1个循环；95℃5 s，60℃34 s，40个循环；95℃15 s，60℃1 min；95℃15 s，1个循环。反应体系为20 μL。

1.8 统计学处理

应用SPSS 17.0统计软件包对数据进行统计学处理。计量资料用，当数据呈正态分布，方差齐时，多个样本均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD方法；当方差不齐时，采用秩和检验。检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 各组A549/DDP细胞对顺铂的敏感性

每组药物处理48 h后，各组对顺铂的IC50结果：空白血清+顺铂组IC50为210.57±1.02；含药血清低剂量+顺铂组IC50为182.95±8.27；含药血清中剂量+顺铂组IC50为85.51±1.54；含药血清高剂量+顺铂组IC50为75.51±10.491。补中益气汤含药血清的高、中、低剂量与顺铂存在协同作用，并且对A549/DDP细胞的抑制作用呈浓度依赖性，随着含药血清浓度的升高IC50不断降低，与空白血清+顺铂组比较，含药血清中剂量+顺铂组和含药血清高剂量+顺铂组可以显著降低A549/DDP对顺铂的IC50，并提高A549/ DDP对顺铂的耐药逆转倍数，其差异有统计学意义（P＜0.05），提示补中益气汤含药血清单独作用可部分逆转A549/DDP对顺铂的耐药。

2.2 各剂量含药血清在不同时间点对A549/DDP细胞的抑制率

含药血清对A549/DDP细胞的抑制率在培养48 h内随着时间的延长抑制作用逐渐增强，各组的抑制率在48 h为最强，与24 h各剂量组比较差异有统计学意义（P＜0.05），且显现出较强的时间-量效关系。而在72 h时，各剂量含药血清的抑制率较48 h均下降，此与细胞在72 h时生长状态下降，死亡细胞增多有关。在作用48 h，含药血清中剂量和高剂量组与含药血清作用24 h的抑制率比较差异都有统计学意义（P＜0.05），但含药血清高剂量组的抑制率最高为11.3±0.011，根据文献［3，4］报道抑制率超过10%其对细胞有毒性作用，在抑制肿瘤细胞生长的同时也会对正常细胞的代谢产生干扰，因此10%中剂量含药血清作用48 h是最佳含药血清和最佳作用时间。见表1。

表1 不同剂量含药血清在不同时间对A549/DDP的抑制率（%）Tab.1 The inhibition rate of A549/DDP by different doses of medicated serum at different time（%）

2.3 免疫细胞化学方法检测A549细胞中PI3K、AKT蛋白表达

在图1、2中，PI3K、p-AKT呈现不同的变化趋势：空白血清组中PI3K和p-AKT的表达都很高，细胞的胞质中有较多的棕褐色的粗大颗粒，最佳含药血清组中两种蛋白的表达都显著减少（P＜0.05），棕褐色颗粒较空白血清组减少且颜色较浅，阻滞剂组中PI3K的表达与空白血清组无差异，联合组中PI3K的表达量与最佳含药血清组相似；而阻滞剂组和联合组仅见极少量的p-AKT表达，与空白血清组相比差异有统计学意义（P＜0.05）。两种蛋白的平均光密度值见图3。

2.4 A549/DDP细胞中PI3K和AKT基因表达

图1 免疫细胞化学法检测A549/DDP细胞中PI3K的表达×200Fig.1 Expression of PI3K in A549/DDP by the immunohistochemical method×200

图2 免疫细胞化学法检测A549/DDP细胞中p⁃AKT的表达×200Fig.2 Expression of p⁃AKT in A549/DDP by the immunohistochemical method×200

图3 免疫组化方法检测A549/DDP细胞中PI3K、p⁃AKT的AOD值Fig.3 AOD for PI3K and p⁃AKT expression in A549/DDP cells by the immunohistochemical method

图6 p⁃AKT熔解曲线Fig.6 Dissociation curve of p⁃AKT

图5 PI3K扩增曲线Fig.5 Amplification curve of PI3K

图7 p⁃AKT扩增曲线Fig.7 Amplification curve of p⁃AKT

RT-PCR检测PI3K、p-AKT的DNA扩增产物，显示熔解曲线无杂峰，平均熔解温度一致，具有特异性，见图4～7。RT-PCR结果表明，A549/DDP细胞中最佳含药血清组的PI3K和p-AKT mRNA表达减少，与空白血清组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；阻滞剂组和联合组PI3K mRNA表达与空白血清组没有差别（P＞0.05）；p-AKT mRNA在阻滞剂组表达与空白血清组无差异，在联合组表达均较空白对照组较少，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

3 讨论

图4 PI3K熔解曲线Fig.4 Dissociation curve of PI3K

表2 各组A549/DDP细胞中PI3K、p⁃AKT mRNA表达水平比较（n=4）Tab.2 Comparison of the mRNA expression level of PI3K and AKT in each group（n=4）

补中益气汤由黄芪、炙甘草、人参、当归、陈皮、升麻、柴胡、白术八味中药组成。此方配伍极为巧妙，黄芪入脾肺经，人参、白术、炙甘草甘温补中，当归养血和营，陈皮调理气机，少入轻清升散的柴胡和升麻，协诸益气之品以升提下陷之中气［5］。肺癌患者的“咳嗽”、“咯血”气短、喘息主要是由于正气虚亏、脾气不足所致，培土生金即是根据中医五行相生、“虚则补其母”的原则制定的治疗方法，即是健脾补肺的方法。肺癌临证中运用培土生金法的代表方——补中益气汤，可扶助正气，促进气血生化，运化痰湿，收到较好的效果［6］。

本实验中所用的含药血清是根据中药血清药理学理论制备而成。血清药理学能够模拟药物在体内环境中药理效应的真实过程，更具科学性和真实性。本实验用MTT法测加入不同剂量的补中益气汤含药血清的A549/DDP细胞对顺铂的敏感性发现，补中益气汤含药血清的高、中、低剂量与顺铂存在协同作用，并且对A549/DDP细胞的抑制作用呈浓度依赖性，含药血清的剂量越大，A549/DDP细胞对顺铂的IC50越小，对顺铂的耐药逆转倍数越大。提示补中益气汤含药血清单独作用可部分逆转A549/DDP对顺铂的耐药。又通过MTT法计算各剂量含药血清对A549/DDP细胞的抑制率，通过统计分析以对A549/DDP细胞抑制率强又没有细胞毒性的10%中剂量含药血清作用48 h作为最佳含药血清和最佳作用时间点，使补中益气汤能够发挥最大的药理效用。

肺腺癌顺铂耐药的分子机制复杂，多种信号通路调控肿瘤的发生。其中，PI3K信号通路尤为受到关注，它可使AKT磷酸化，进而激活或抑制其下游众多靶蛋白，从而调节肿瘤细胞的生物学行为。Westfall等［7］报道，顺铂在多种肿瘤细胞中激活PI3K/Akt信号通路，并与这些细胞对药物的抵抗有关。A549/DDP是对顺铂耐药的细胞株，本研究结果显示，应用最佳含药血清能显著降低A549/DDP细胞内PI3K和p-AKT的蛋白和mRNA水平，与空白血清组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），提示最佳含药血清可能通过抑制A549/DDP细胞中PI3K和p-AKT基因的表达降低细胞中蛋白的含量，最佳含药血清的作用位点可能在PI3K的基因水平上。LY294002是特异性抑制PI3K p110亚单位的催化活性，其是通过抑制PI3K的蛋白磷酸化发挥作用，对PI3K的抑制是在其转录、翻译、修饰之后蛋白水平上进行的，阻滞剂组PI3K mRNA和蛋白的表达与空白血清组均无差别，而在应用LY294002后，p-AKT蛋白的表达被阻断，但其mRNA的表达没有明显改变，推测其原因为LY294002只阻断了Akt蛋白的磷酸化，并不影响其基因的表达，因此表现出蛋白表达和基因表达水平的不一致，这与文献［8］报道是一致的。中剂量含药血清作为补中益气汤最佳浓度的含药血清，可有效降低A549/DDP细胞中PI3K、p-AKT基因和蛋白的表达，本实验结果提示补中益气汤可通过抑制A549/DDP细胞中PI3K的基因表达从而减少PI3K蛋白、磷酸化p-AKT蛋白的表达，逆转顺铂耐药，使顺铂对A549/DDP细胞具有增效作用。

［1］尤建良.晚期肺癌治疗经验［J］.时珍国医国药，2007，18（1）：205-207.

［2］施新猷.现代医学实验动物学［M］.北京：人民军医出版社，2000.

［3］吴翠芳，曾嵘，周于露，等.芦荟大黄素对人肺腺癌细胞顺铂多药耐药性的逆转作用［J］.中国医院药学杂志，2008，28（13）：1061-1063.

［4］王玲，刘世昆，周于禄，等.华蟾素对人乳腺癌细胞阿霉素多药耐药性的逆转作用［J］.中国药理学通报，2007，23（5）：677-680.

［5］朱晓琳，李文林.补中益气汤研究进展［J］.辽宁中医药大学学报，2011，13（11）：104-105.

［6］黄倩，杨卫彬.补中益气汤临床应用浅析［J］.中医学报，2013，28（2）：61-62.

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（编辑裘孝琦）

Experimental Research on Effect of Buzhong Yiqi Decoction Medicated Serum on PI3K/AKT Signal Transduction Pathway in Lung Adenocarcinoma CellLinesofA549/DDP

LIUYa-li1，2，YIJia-li1，WANGYing1，JINGHuan1，LIUChun-ying1
（1.Department of Pathological，College of Preclinical Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang 110032，China；2.Department of Health Inspection，DepartmentofMedicalTechnology，Liaoning College ofHealth VocationalTechnology，Shenyang 110101，China

ObjectiveTo observe the inhibitory effect of the Buzhong Yiqi Decoction medicated serum on lung adenocarcinoma A549/DDP cells and to discuss its influence on PI3K and AKT protein and mRNA expression.MethodsSD rats were randomly divided into 4 groups：the higher dosage group，the moderate dosage group，the lower dosage group and the blank control group.The best medicated serum was determined by the MTT method.A549/DDP cells were divided into the blank serum group，the best medicated serum group，the LY294002 group（blockers group），the best medicated serum+LY294002 group（combination group）and the negative control group.The immunocytochemistry method and real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction（RT-PCR）were adopted to detect the protein expression and mRNA expression of PI3K and AKT.ResultsWith the increase in medicated serum concentration，IC50of each group was decreased and the RIof cisplatin was increased.By rolling a moderate dose ofmedicated serum for48 hours，the bestmedicated serum was produced and 48 hours was the besttime.The bestmedicated serum reduced PI3K and p-AKT protein expression in A549/DDP cells.Compared with the blank serum group，the difference is statistically significant（P＜0.05）.The Buzhong Yiqi Decoction induced mRNA expression of PI3K and p-AKT in A549/DDP cells significantly reduced.Compared with the blank serum group，the difference isstatistically significant（P＜0.05）.Conclusionthe Buzhong YiqiDecoction can reduce the expression levels of PI3K and p-AKT mRNA，which in turn influences PI3K/AKT signal transduction pathway and thus plays a role of sensitization of cisplatin resistance.

Buzhong Yiqi Decoction；PI3K；AKT

R-33

A

0258-4646（2014）01-0014-05

国家自然科学基金（81072743）

刘亚莉（1977-），女，副教授，博士研究生.

刘春英，E-mail：1243618563@qq.com

2013-08-28

网络出版时间：