人肺腺癌中RhoA的表达及临床意义

（中国医科大学附属第四医院胸外科，沈阳110032）

人肺腺癌中RhoA的表达及临床意义

徐宝宁，姜文军，田大力
（中国医科大学附属第四医院胸外科，沈阳110032）

目的检测人肺腺癌组织及其对应的癌旁肺组织中RhoA的表达，研究RhoA与肺腺癌发生和侵袭转移的关系，探讨其在肺腺癌发生、发展中的作用。方法选取有完整临床资料的30例肺腺癌组织和30例对应的癌旁肺组织，应用实时PCR方法检测2组中RhoA mRNA的表达情况。结果实时PCR结果显示：在30例肺腺癌组织中26例（86.7%）RhoA mRNA表达水平明显高于对应的癌旁肺组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。RhoA mRNA表达与病理分期、淋巴结转移有关。结论RhoA mRNA表达可能与肺腺癌的发生有关，参与了肺腺癌的浸润转移及淋巴转移，有望作为肺腺癌预后和转移指标。

RhoA；肺腺癌；侵润转移；实时PCR

肺腺癌已成为最常见的肺癌类型，而且也是非吸烟人群中最常见的肺癌类型［1］。近年来随着环境污染的加重，肺腺癌的发病率呈上升及年轻化趋势［2］。RhoA是小分子G蛋白Rho家族成员之一，参与细胞骨架的组装、细胞黏附、细胞运动、细胞周期进展、细胞分裂及基因转录等多种生命过程的调节［3］。多项研究已经证实Rho家族成员在胃癌、肝癌、食管癌、卵巢癌等多种癌组织中存在过度表达，并且与肿瘤的侵袭、转移密切相关［4～7］。本研究采用实时PCR法检测肺腺癌组织及其对应的癌旁肺组织中RhoA mRNA的表达水平，探讨其在人肺腺癌组织及对应的癌旁肺组织中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料

30例肺腺癌组织及30例对应的癌旁肺组织标本均来自2008-2011年于中国医科大学附属第四医院接受肺癌切除术的患者。其中男性12例，女性18例，年龄36～73岁，平均60岁。根据国际抗癌联盟肺癌的TNM分期标准：Ⅰ期6例，Ⅱ期14例，Ⅲ期10例；发生淋巴结转移的22例。所有病例均为初发，临床病理资料完整，患者术前均未接受放、化疗。

1.2 主要试剂

RhoA及GAPDH引物片段、总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒及实时定量PCR反应试剂盒均购于宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 实验方法

术中取得标本离体后放入液氮中保存，再转移到-80℃冰箱中保存。实时PCR引物序列通过Gen-

Bank查找全序列，Primer5.0软件自行设计。RhoA引物序列：上游5′-TGATTGTTGGTGATGGAGCCT-3′，下游5′-ACTCTACCTGCTTTCCATCCAC-3′，产物片段长138 bp。由人GAPDH作为内参照进行定量分析，GAPDH引物序列：上游5′-GGTGGTCTCCT CTGACTTCAACA-3′，下游5′-GTTGCTGTAGCCAA ATTCGTTGT-3′，产物片段长127 bp。总RNA的提取：取50 g标本，按宝生物总RNA提取试剂盒进行操作，提取后将总RNA溶解于DEPC水（15～40 μL）中，-80℃保存。cDNA的合成：根据提取的RNA浓度取RNA 500 ng，配制成10 μL逆转录反应体系（5× PrimeScript Buffer 2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 μL，Oligo dT Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，RNase Free dH2O 5.5 μL）。以37℃15 min孵育，80℃5 s终止反应，4℃保存，-20℃长期保存。使用ABI7300实时定量PCR仪进行聚合酶链反应：20 μL反应体系（10 μL SYBR Premix Ex Taq，0.4 μL RhoA或GAPDH上游引物，0.4 μL RhoA或GAPDH下游引物，0.4 μL ROX Reference Dye，2 μL cNDA，6.8 μL dH2O），反应条件：阶段1：95℃30 s，1个循环；阶段2：95℃5 s，60℃31 s，40个循环；添加溶解曲线：95℃15 s，60℃30 s，95℃15 s。基因的相对△Ct=Ct目的基因-Ct内参。相对表达量的计算采用2-△△Ct法。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0统计分析软件。计量资料用x± s表示，采用配对样本t检验进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RhoA mRNA在肺腺癌及癌旁肺组织中的表达

实时PCR结果显示：在30例肺腺癌组织中，26例（86.7%）RhoA mRNA表达水平（0.049 236±0.022 896）明显高于对应的癌旁肺组织（0.006 275±0.003 167），差异有统计学意义（P＜0.05）。实时定量PCR具体溶解曲线及扩增曲线，见图1。

2.2 RhoA mRNA的表达与肺腺癌临床病理特征的关系

RhoA mRNA的表达水平在不同临床分期中不同，肺癌Ⅱ、Ⅲ期患者（0.062 746±0.031 963）的表达水平显著高于Ⅰ期患者（0.004 258±0.002 286），N1+ N2组患者（0.082 776±0.045 962）的表达水平明显高于N0组患者（0.007 845±0.003 298），差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 扩增曲线及溶解曲线Fig.1 The amplification curve and dissociation curve

3 讨论

肺癌的发病率和死亡率已跃居各类恶性肿瘤的首位，肺腺癌已成为最常见的肺癌类型，而且也是非吸烟人群中最常见的肺癌类型，男性患者的比例也呈上升趋势。其中肿瘤的侵袭、转移是影响其预后的最主要因素，这个过程涉及到多种细胞因子、黏附分子及基质蛋白酶的改变。

Rho蛋白是一种具有GTP酶活性的小分子G蛋白，主要包括Rho、Rac、Cdc42三个亚家族，至少包括23个成员，RhoA是小分子G蛋白Rho家族成员之一，参与细胞骨架的组装、细胞黏附、细胞运动、细胞周期进展、细胞分裂及基因转录等多种生命过程的调节［3］。多项研究已经证实Rho家族成员在胃癌、卵巢癌、直肠癌、口腔鳞状细胞癌等多种癌组织中存在过度表达，并且与肿瘤的侵袭、转移密切相关［4～7］。有研究报道，应用小干扰RNA沉默RhoA和RhoC表达，构建重组质粒后转染进入人的乳腺癌细胞株，观察重组质粒对细胞的影响，实验显示重组质粒对抑制癌细胞侵袭及转移有效［8］。本研究显示，在30例肺腺癌组织中，26例（86.7%）RhoA mRNA表达水平明显高于对应的癌旁肺组织。RhoA的表达与肿瘤的临床分期和淋巴结转移等情况有密切联系。RhoA mRNA表达在不同TNM分期有显著差异，随着肺腺癌临床分期的增高，RhoA的表达也增加，在Ⅱ、Ⅲ期患者的表达水平明显高于Ⅰ期，根据此结果可推测RhoA参与了肺腺癌的发生过程。N1+N2组患者的表达水平明显高于N0组，表明RhoA的表达水平与淋巴结转移密切联系，提示RhoA参与了肺腺癌的发生过程，RhoA高表达可

促进肺腺癌细胞的侵袭性，为以后应用RhoA作为评估肺腺癌恶性程度、转移能力的指标提供了理论依据。RhoA mRNA高表达可能与肺腺癌的发生有关，参与了肺腺癌的浸润转移及淋巴转移，有望作为肺腺癌预后和转移指标。

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（编辑陈姜）

Expression and ClinicalSignificanceof RhoA in Human Lung Adenocarcinoma

XUBao-ning，JIANGWen-jun，TIANDa-li
（DepartmentofThoracic Surgery，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

ObjectiveTo determine different expression of RhoA mRNA in human lung adenocarcinoma tissues，investigate the correlation of RhoA with the occurrence，invasion，and metastasis of lung adenocarcinoma，and discuss its role in occurrence and development of lung adenocarcinoma.MethodsRhoA mRNA expression in 30 cases of lung adenocarcinoma tissues and their corresponding normal tissues were analyzed，using quantitative real-time PCR.ResultsOur results showed that among 30 lung adenocarcinoma tissues，26（86.7%）exhibited higher levels of RhoA mRNA compared with their corresponding normal tissues，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.RhoA mRNA expression was associated with clinicalpathologicalstage，and lymph node metastasis.ConclusionRhoA mRNAexpression may be correlated to the occurrence of lung adenocarcinoma.It was involved in the invasion and lymph node metastasis of lung adenocarcinoma，which may be expected as an indicator for metastasis oflung adenocarcinoma and an predictorofprognosis.

RhoA；lung adenocarcinoma；invasion and metastasis；real-time PCR

R734.2

A

0258-4646（2014）01-0049-03

辽宁省科学技术计划（2013408001）

徐宝宁（1964-），男，副主任医师，博士. E-mail：johonei@sina.com

2013-11-22

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