复合酶制剂羊饲料添加剂中纤维素酶和淀粉酶影响因素的研究

李忠玲，徐升运，李文孝，李本光，岳淑宁，张红艳，赵文娟，付博

（1.陕西省科学院酶工程研究所，陕西西安710600；2.陕西省酶工程技术中心，陕西西安710600）

复合酶制剂羊饲料添加剂中纤维素酶和淀粉酶影响因素的研究

李忠玲1，徐升运1，李文孝1，李本光2，岳淑宁2，张红艳1，赵文娟2，付博2

（1.陕西省科学院酶工程研究所，陕西西安710600；2.陕西省酶工程技术中心，陕西西安710600）

研究了蛋白酶对纤维素酶、淀粉酶活力的影响，结果表明淀粉酶对蛋白酶比较敏感，淀粉酶在质量浓度为150 U/mL的蛋白酶条件下37℃处理30 min，相对酶活力为75.79%。研究了纤维素酶和淀粉酶的热稳定性，结果表明与纤维素酶相比，淀粉酶对高温更敏感，淀粉酶在100℃的沸水中处理1 min，相对酶活力为1.89%。研究了金属离子对纤维素酶和淀粉酶的影响，结果表明，对于纤维素酶激活作用大小顺序依次为Cu2+＞Zn2+＞Co2+＞Mn2+＞Fe2+，抑制作用大小顺序依次为Mn2+＞Fe2+＞Co2+＞Zn2+＞Cu2+；对于淀粉酶激活作用不明显,抑制作用大小顺序依次为Fe2+＞Cu2+＞Mn2+＞Zn2+＞Co2+。以上研究的目的是为酶在饲料中的应用提供参考。

纤维素酶；淀粉酶；酶制剂；饲料添加剂

酶是由生物的活细胞产生的具有催化功能的蛋白质，只要不处于变性状态，无论在细胞内或细胞外都可发挥催化化学反应的作用[1]。生物酶制剂对于饲料工业的发展起到了极大的促进作用[2]。饲用酶制剂一直是饲料添加剂领域最为引人关注的研究热点之一，其的应用对于提高动物生产性能与福利、改善饲料资源利用效率、减少环境污染发挥巨大作用，对于促进饲料行业的发展产生巨大的推动作用[3]。相关研究较多，周晓娟等[4]在日粮中添加复合酶，试验组每天每头奶牛比对照组多盈利3.88元；杜忍让等[5]研究不同日粮酶制剂水平对奶牛产奶性能的影响表明，试验组奶牛日均产奶量比对照组提高3.64 kg/d，增加了12.22%；刘成更等[6]进行复合酶饲料添加剂对荷斯坦乳牛的饲喂试验表明，在奶牛饲料中添加复合酶饲料添加剂可使乳产量提高7.62%，乳成分有所改善，乳脂率提高10%，该添加剂对乳房炎有一定治疗作用，可使体细胞数明显下降。杜忍让等[7]用复合酶制剂饲喂青年羊，经济效益比对照组多收益34.08元/只；张琨[8]的研究表明，复合酶制剂可提高产奶量59.09%。酶的化学本质是蛋白质，因此酶具有蛋白质的一般特性，即具有高分子量、两性电解质、不耐热性等，一切使蛋白质变性的因素如热、紫外线、X射线、强酸、强碱、重金属离子等都可以破坏其结构而变性[9]。本研究对自制的复合酶制剂羊饲料添加剂中纤维素酶和淀粉酶影响因素进行考察，以期为酶制剂的稳定性研究及在饲料工业中的应用研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

饲用复合酶（主要酶组分为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、木聚糖酶等）：陕西省科学院酶工程研究所自行研制。

1.2 仪器与设备

752N紫外可见分光光度计：上海精密仪器有限公司；PHSJ-4A实验室pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；HH.W21.600S数显电热恒温水温箱：上海跃进医疗器械厂；800B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；DH-101-2PS电热恒温鼓风干燥箱：天津市中环实验电炉有限公司。

1.3 方法

蛋白酶活力测定：Folin显色法（QB/T 1803—1993《工业酶制剂通用试验方法》）[9]；纤维素酶活力测定：DNS法（QB 2583—2003《纤维素酶制剂》）[10]；淀粉酶活力测定：比色法（GB 8275—2009《食品添加剂α-淀粉酶制剂》）[11]。

2 结果与分析

2.1 蛋白酶对主要酶制剂的影响

因为酶的本质是蛋白质，所以酶在蛋白酶的作用下会不同程度的发生降解，从而影响了酶的空间构象，最终影响酶的活性。本试验研究了蛋白酶对主要酶制剂中的纤维素酶和淀粉酶活性的影响。

2.1.1 蛋白酶对淀粉酶的影响

淀粉酶分别用不同酶活的蛋白酶（50 U/mL、100 U/mL、150 U/mL）于37℃分别处理不同时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min），取出稀释相应的倍数测淀粉酶活力，结果见图1。

图1 蛋白酶对淀粉酶的影响Fig.1 Effects of protease on amylase activity

随着处理时间的延长，淀粉酶活性不断下降。当蛋白酶酶活为50 U/mL时相对酶活力在60 min时降至92.96%；当蛋白酶酶活为100 U/mL时相对酶活力在60 min时降至61.06%；当蛋白酶酶活为150 U/mL时相对酶活力在60 min时降至60.15%。可以看出，随着蛋白酶酶活的增加，淀粉酶活力的降低速度加快，从而得出结论，淀粉酶对蛋白酶比较敏感。但从图1的曲线来看，当蛋白酶酶活增至150 U/mL时，淀粉酶相对活力下降的速度与蛋白酶酶活为100 U/mL时相比有放缓的趋势。

2.1.2 蛋白酶对纤维素酶的影响

纤维素酶分别用不同酶活的蛋白酶（0～1 000 U/mL）于37℃处理30 min，取出稀释相应的倍数测纤维素酶活力，结果见图2。

图2 蛋白酶对纤维素酶活力的影响Fig.2 Effects of protease on cellulase activity

从图2可以看出，总的趋势是随着蛋白酶酶活的增加，纤维素酶活力的降低速度加快。但在蛋白酶酶活为300 U/mL和400 U/mL时纤维素酶活力略有提高，可能是在该蛋白酶酶活的作用下原来已经失去活性的酶分子活性中心重新暴露出来而显示了酶活性，具体原因还有待于进一步研究。

比较图1和图2，从图1看出，淀粉酶在蛋白酶酶活为150 U/mL的条件下处理30 min，相对酶活力为75.79%。从图2看出，纤维素酶在的蛋白酶酶活为200 U/mL的条件下处理30 min，残余酶活力为99.88%。纤维素酶在蛋白酶酶活为1 000 U/mL的条件下处理30 min，残余酶活力为87.39%，明显高于淀粉酶。从比较得出，在相同蛋白酶酶活条件下处理相同时间，淀粉酶相对较为敏感。

2.2 纤维素酶和淀粉酶的耐高温性能

酶是蛋白质，其三级结构是酶的物理性质催化作用的根源。所有蛋白质被加热能破坏其三级结构。随着温度的升高，最终蛋白质被彻底破坏，酶不再起催化作用[12]。羊是草食动物，饲料中纤维含量较高，所以饲料添加剂中纤维素酶占主要成分。本研究对纤维素酶和淀粉酶的耐高温性能进行了测定。

2.2.1 温度对纤维素酶的影响

将纤维素酶溶解过滤，滤液分别在50～100℃处理30 min，酶液稀释相应的倍数测定纤维素酶残余酶活力，结果见图3。从图3可知，在50～70℃酶活力几乎呈直线下降趋势，相对酶活力从79.44%降低至11.72%。70℃之后下降趋势放缓，在70～100℃相对酶活力从11.72%降低至2.82%，说明该纤维素酶不宜在高于50℃条件下使用。

2.2.2 纤维素酶在高温条件下的热稳定性

将纤维素酶溶解过滤，滤液分别在90℃和100℃处理0～30 min，酶液稀释相应的倍数测定纤维素酶残余酶活力，结果见图4。

图3 温度对纤维素酶活力的影响Fig．3 Effects of temperature on cellulase activity

图4 高温对纤维素酶活力的影响(0～30 min)Fig．4 Effects of high temperature on cellulose activity(0-30 min)

从图4可知，在90℃和100℃条件下，纤维素酶活性下降非常快，在5 min时，90℃条件下相对酶活力为6.36%，100℃条件下相对酶活力为4.65%。之后下降趋势趋于平缓，100℃保温30 min，纤维素酶仍有2.82%的酶活性残余，这些残余的酶抵抗高温的机理及如何进一步提高酶的热稳定性有待进一步研究。从图4可知，纤维素酶在前5 min活力迅速下降，为了更清楚的反映酶活力的下降过程，对前10 min酶活性下降趋势进行了研究，结果见图5。从图5可知，在90℃条件下处理1 min，酶活力下降至46.18%，在90℃条件下处理2 min，酶活力下降至16.64%。在100℃条件下处理1 min，酶活力下降至6.29%。这说明饲料工艺中的高温造粒对酶制剂不适用。

图5 高温对纤维素酶活力的影响(0～10 min)Fig．5 Effects of high temperature on cellulose activity(0-10 min)

2.2.3 高温对淀粉酶的影响

将淀粉酶溶液置于100℃的沸水中，处理0～10 min，测定残余的酶活力，计算酶活力相对值，结果见表1。

表1 高温对淀粉酶活力的影响Table 1 Effects of high temperature on amylase activity

从表1可知，淀粉酶在100℃的沸水中放置1 min，相对酶活力为1.89%，放置2 min后因酶活力过低而未检出。从加热过程的现象来看，高温处理会使淀粉酶分子变性絮凝，失去酶活性。从淡黄色的酶液放入沸水中开始，就开始有絮凝出现，而且随着时间的延长絮凝物增多，到5 min时絮凝物聚集成团状，液体变为无色清亮状，表示酶分子已基本絮凝完全。

从图5和表1可知，纤维素酶在100℃的沸水中放置1 min，相对酶活力为4.65%，在放置10 min时相对酶活力为2.82%。而淀粉酶在100℃的沸水中放置1 min，相对酶活力为1.89%，放置2 min后因酶活力过低而未检出。可见，与纤维素酶相比，淀粉酶对高温更敏感。

2.3 饲料中其他添加成分对酶制剂的影响

2.3.1 NaCl对淀粉酶的影响

淀粉酶分别用不同质量分数NaCl溶液（0～35%）于37℃处理30 min，取出稀释相应的倍数测淀粉酶活力，结果见图6。

图6 NaCl对淀粉酶活力的影响Fig．6 Effects of NaCl on amylase activity

从图6可知，NaCl质量分数＜10%时对淀粉酶基本无影响，当NaCl质量分数＞10%时，淀粉酶随着NaCl质量分数的增加活性下降，但下降的趋势较缓。

2.3.2 麦饭石对淀粉酶的影响

分别称淀粉酶1.0g，加入麦饭石粉0g、0.5g、1.0g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g、3.5 g、4.0 g，搅拌，定容至100 mL，摇匀，放置30 min，过滤，将滤液稀释相应的倍数进行淀粉酶活力测定，结果见图7。

图7 麦饭石对淀粉酶活力的影响Fig.7 Effects of medical stone on amylase activity

从图7可知，麦饭石对淀粉酶有影响，随着麦饭石添加量的增加，淀粉酶活力表现出下降的趋势，这可能是因为麦饭石的吸附作用造成的。

2.4 金属离子对纤维素酶活力和淀粉酶活力的影响

金属离子对酶的影响往往与酸催化的影响相似，而且作用很强。金属离子还可参加氧化还原反应，作用是多方面的[14]。也可能是因为离子的电负性，对酶产生诱导效应。

取1 g饲料复合酶，用相应缓冲液充分溶解并浸提30 min后定容，经四层脱脂纱布过滤，滤液保存至0～4℃冰箱内备用，使用时稀释一定倍数。用蒸馏水配制一定摩尔浓度的金属离子溶液，用时稀释至需要的浓度。用等体积蒸馏水代替离子溶液作空白，测定酶液在不同离子浓度条件下37℃保温30 min后的相对酶活力。

2.4.1 金属离子对纤维素酶活力的影响

研究了5种金属离子对纤维素酶活力的影响，结果见表2。

表2 不同金属离子对纤维素酶活力的影响Table 2 Effects of different metal ions on cellulase activity

由表2可见，5种金属离子在低浓度条件下对酶的活性普遍无明显影响，但随着浓度的增加，不同金属离子对酶活性的影响越来越明显。从单个金属离子来分析，Cu2+在不同浓度条件下对纤维素酶都表现出激活作用，在10-3mol/L浓度下对酶活的激活作用最大，可使相对酶活力达到132.45%；Cu2+的激活作用可能是它能使底物更有利于与酶的活性部位相结合而加速反应进行[15]。Fe2+在低浓度条件下对酶活无明显影响，但当浓度继续增大到10-2mol/L后，酶活丧失较大，相对酶活为88.98%；Zn2+的影响趋势是随着浓度的增加激活作用加大，在10-2mol/L浓度条件下可使相对酶活力达到110.03%；Mn2+的影响趋势与Zn2+相反，随着浓度的增加抑制作用加大，并且其抑制作用明显大于Fe2+，在10-2mol/L浓度条件下可使相对酶活力降低到68.73%；Co2+随着浓度的增加激活作用加大，在10-3mol/L浓度条件下达到最大，为112.09%，之后开始下降，在10-2mol/L浓度条件下表现为抑制作用。总体来说，金属离子对于纤维素酶激活作用大小顺序依次为Cu2+＞Zn2+＞Co2+＞Mn2+＞Fe2+，抑制作用大小顺序依次为Mn2+＞Fe2+＞Co2+＞Zn2+＞Cu2+。

2.4.2 金属离子对淀粉酶活力的影响

研究了5种金属离子对淀粉酶活力的影响，结果见表3。

表3 不同金属离子对淀粉酶活力的影响Table 3 Effects of different metal ions on amylase activity

由表3可见，5种金属离子在低浓度条件下对酶的活性普遍无明显影响，但随着浓度的增加，不同金属离子均对酶活性产生了抑制作用。从单个金属离子来分析，Cu2+在不同浓度下对纤维素酶都表现出抑制作用，在10-2mol/L浓度条件下可使相对酶活力降低到84.27%；Fe2+在低浓度条件下对酶活无明显影响，但当浓度继续增大到10-2mol/L后，相对酶活为83.18%；Zn2+、Mn2+、Co2+的影响均不明显，但总趋势也是随着浓度的增加抑制作用加大，在10-2mol/L浓度条件下相对酶活分别为97.94%、96.83%、97.92%。总体来说，金属离子对于淀粉酶激活作用不明显，抑制作用大小顺序依次为Fe2+＞Cu2+＞Mn2+＞Zn2+＞Co2+。

3 结论

通过研究蛋白酶对纤维素酶、淀粉酶活力的影响发现，淀粉酶在浓度为150 U/mL的蛋白酶条件下处理30 min，相对酶活力为75.79%，纤维素酶在浓度为200 U/mL的蛋白酶条件下处理30 min，残余酶活力为99.88%。纤维素酶在浓度为1 000 U/mL的蛋白酶条件下处理30 min，相对酶活力为87.39%，明显高于淀粉酶。从比较得出：在相同蛋白酶浓度条件下处理相同时间，淀粉酶相对较为敏感。通过研究纤维素酶、淀粉酶活力的热稳定性发现，纤维素酶在100℃的沸水中放置1 min，相对酶活力为4.65%，在放置10 min时相对酶活力为2.82%。而淀粉酶在100℃的沸水中放置1 min，相对酶活力为1.89%，放置2 min后因酶活力过低而未检出。可见，与纤维素酶相比，淀粉酶对高温更敏感。通过研究NaCl与麦饭石对淀粉酶的影响发现，NaCl质量分数＜10%时对淀粉酶基本无影响，当NaCl质量分数＞10%时，淀粉酶随着NaCl质量分数的增加活性下降，但下降的趋势较缓；麦饭石对淀粉酶的影响不大，但随着麦饭石添加量的增加，淀粉酶表现出活力下降的趋势。通过研究金属离子对纤维素酶活力的影响发现，不同金属离子在不同的浓度下对自行研制的饲料复合酶中纤维素酶的活力影响有很大不同。总体来说，对于纤维素酶激活作用大小顺序依次为Cu2+＞Zn2+＞Co2+＞Mn2+＞Fe2+。抑制作用大小顺序依次为Mn2+＞Fe2+＞Co2+＞Zn2+＞Cu2+；对于淀粉酶激活作用不明显，抑制作用大小顺序依次为Fe2+＞Cu2+＞Mn2+＞Zn2+＞Co2+。

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Influence factors of cellulase and amylase of compound enzyme preparation in sheep feed additive

LI Zhongling1,XU Shengyun1,LI Wenxiao1,LI Benguang2,YUE Shuning2,ZHANG Hongyan1,ZHAO Wenjuan2,FU Bo2
(1.Institute of Enzyme Engineering,Shaanxi Province Academy of Sciences,Xi'an,710600,China; 2.Enzyme Engineering Technology Center of Shaanxi Province,Xi'an,710600,China)

The effect of protease on the activity of cellulase and amylase was studied,and result showed that amylase was more sensitive to protease than cellulase.The relative enzymatic activity of amylase was 75.79%when treated in 150 u/ml protease at 37℃for 30 min.The thermostabilities of cellulase and amylase were tested and the results showed that amylase was more sensitive to high temperature than cellulase.The relative enzyme activity of amylase was 1.89%when treated in 100℃water for 1 min.Effects of different metal ions on the activity of cellulase and amylase were tested and the results showed that activation effect on cellulase ranked in order was Cu2+,Zn2+,Co2+,Mn2+and Fe2+,the inhibition effect on cellulase ranked in order was Mn2+,Fe2+,Co2+,Zn2+and Cu2+.Activation effect on amylase was not distinct and inhibition effect on amylase ranked in order was Fe2+,Cu2+,Mn2+,Zn2+and Co2+.The research purpose was to provide a convenient reference for further research about enzyme applications to feed.

cellulase;amylase;enzyme preparation;feed additive

S816.7

A

0254-5071（2014）11-0085-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.019

2014-09-05

陕西省科学院应用基础项目（2012K-15）；陕西省科技统筹创新工程难题攻关项目（2013KTZB02-02-02）

李忠玲（1973-），女，副研究员，硕士，研究方向为生物技术。