HPLC法同时测定中药菟丝子中五种黄酮类成分含量的研究

许晓嘉 徐丽媛 郭志勇 潘丽丽 袁少雄 郝 变 吕剑波 李向日

（北京中医药大学中药学院，北京，100102）

中药研究

HPLC法同时测定中药菟丝子中五种黄酮类成分含量的研究

许晓嘉 徐丽媛 郭志勇 潘丽丽 袁少雄 郝 变 吕剑波 李向日

（北京中医药大学中药学院，北京，100102）

目的：建立中药菟丝子中金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的含量的高效液相色谱测定方法。方法：采用Agilent TC C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流动相为甲醇-0.4%磷酸，紫外检测器：检测波长360 nm，流速为1 mL/min，梯度洗脱：0→60min→80min，甲醇的比例由25%→40%→60%，柱温45℃，测定中药菟丝子中5种黄酮类成分的含量。结果：色谱峰分离情况良好，菟丝子中5种化学成分在各自的浓度范围内均具有良好的线性关系；加样回收率为98.0%～102.2%，RSD为1.44%～2.63%。结论：所建方法简便、准确，重现性好，可用于菟丝子药材的质量评价。

HPLC；菟丝子；黄酮类成分

菟丝子为旋花科植物南方菟丝子Cuscuta australis R.Br.或菟丝子Cuscuta chinensis Lam.的干燥成熟种子[1]。中药菟丝子是临床上常用的补阳药，始载于《神农本草经》，并被列为上品，具有补肝肾、益精明目、安胎等功效，是中医补肾壮阳的要药。现代药理研究表明黄酮类成分具有增强生殖系统作用[2-4]，提高心血管系统功能，提高免疫力、抗氧化[2-4]、抗衰老[2-4]、抗癌[2-4]、保肝明目等作用，黄酮类成分是菟丝子的主要有效成分。目前文献[5-6]报道菟丝子的黄酮类成分主要有金丝桃苷、紫云英苷、山柰酚、槲皮素、异鼠李素、槲皮素-3-O-β-D-半乳糖（2-1）β-D-芹糖苷等，因此本研究选择菟丝子和南方菟丝子中共有五种单体黄酮，即金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素（化学结构式如图1）作为指标性成分，建立其含量测定的方法。本文首次采用HPLC法对菟丝子中五种黄酮成分进行同时测定。

1 仪器、试剂与试药

Waters液相色谱仪包括1525色谱泵，2489双波长紫外检测器，Breeze工作站；金丝桃苷（111521-200303）、紫云英苷（MUST-09030603）、槲皮素（100081-200907）、山柰酚（110861-200808）、异鼠李素（110860-200608）、绿原酸（110753-200413），购于中国食品药品检定研究院；甲醇色谱纯、磷酸（分析纯）、甲醇分析纯、娃哈哈纯净水。

菟丝子（批号：090215为样品1，100523为样品2）产地为黑龙江，河北光明饮片有限公司饮片厂供应；菟丝子（批号：110301为样品3，090601为样品4）产地内蒙古，哈尔滨市盛泰中药饮片加工厂提供。样品1和3为南方菟丝子（Cuscuta australis R.Br.），样品2和4为菟丝子（Cuscuta chinensis Lam.），其中混有少量南方菟丝子（Cuscuta australis R.Br.）。所有样品均经北京中医药大学杨瑶珺教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent TC C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相：甲醇-0.4%磷酸；紫外检测器：检测波长360 nm；流速为1 mL/min；进样量15μL，柱温45℃。梯度洗脱：0→60 min→80 min，甲醇的比例由25%→40%→60%。

2.2 标准品溶液的制备 精确称取金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素各1.00mg，甲醇定容于10 m L，作为标准品溶液，色谱图见图2。

2.3 供试液的制备 精密称取菟丝子过60目粉末1.00 g，精密加入50 mL 80%甲醇溶液，密塞称重，回流提取2 h，冷却后补重，经0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液。

2.4 标准曲线的绘制

2.4.1 金丝桃苷标准曲线的绘制 精确称取金丝桃苷10.20 mg，定容于20mL，分别精密吸取0.1mL、0.4 mL、4 mL、6 mL、8 m L的原液定容于10 mL。原液和各稀释液分别进样25μL，以峰面积对质量作回归曲线方程，经计算得y＝2 323 873x+173 893，r＝0.999 9。

2.4.2 紫云英苷标准曲线的绘制 精密称取紫云英苷对照品9.96 mg，定容于20 mL，分别精密吸取0.125 mL、0.5 mL、1.25 mL、2.5 m L、3.75 mL、5 m L的原液定容于10 mL。各稀释液分别进样20μL，以峰面积对质量作回归方程，经计算得y＝2 802 318x-83 742，r＝0.999 9。

2.4.3 槲皮素标准曲线的绘制 精密称取槲皮素对照品5.20 mg，定容于50 mL，分别精密吸取0.1 mL、0.6mL、5mL、10mL、15mL的原液定容于20 mL，原液和各稀释液进样20μL，以峰面积对质量作回归方程，经计算得y＝4 178 732x+12 709，r＝0.999 9。

2.4.4 山柰酚标准曲线的绘制 精密称取山柰酚对照品5.10 mg，定容于50 mL，分别精密吸取0.1 mL、0.4 mL、5 mL、10 mL、15 m L的原液定容于20 mL，原液和各稀释液进样20μL，以峰面积对质量作回归方程，经计算得y＝4 477 936x-29 527，r＝0.999 9。

2.4.5 异鼠李素标准曲线的绘制 精密称取异鼠李素对照品5.01 mg，定容于100 mL，分别精密吸取0.05 mL、0.2 mL、5 m L、10 m L、15 m L的原液定容于20 m L，原液和各稀释液进样20μL，以峰面积对质量作回归方程，经计算得y＝4 681 860x-28 099，r＝0.999 9。

2.5 精密度考察 按“2.1”项下方法，各对照品溶液分别进样10μL，测得金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的峰面积值，平行测定6份，其RSD分别为2.27%、2.22%、1.42%、1.72%和1.77%。

2.6 稳定性考察 按“2.3”项下方法制备供试品溶液1份。按照“2.1”项下液相条件，测定2、4、6、8、10、12、16、24 h内测得金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的峰面积值的峰面积。其RSD分别为3.05%、1.29%、2.57%、2.10%和1.03%。说明：供试品溶液在放置24 h内是稳定的。

2.7 重复性考察 按照“2.3”项下方法同时制备6份供试品溶液。照“2.1”项下方法分别进样15μL，测得金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚和异鼠李素的峰面积值的峰面积。其RSD分别为2.21%、2.21%、2.22%、2.21%和1.55%。

2.8 加样回收率实验 精密称取菟丝子过60目粉末0.5 g，加入各对照品适量，按照“2.3”项下方法同时制备6份供试品溶液，照“2.1”项下液相条件进样15 μL，记录峰面积，计算含量和回收率，结果见表1。

表1 加样回收率结果

图1 化合物的结构式

2.9 样品的含量测定 取不同产地不同批次的菟丝子药材，按照供试品溶液的制备方法得到样品溶液，按照液相条件测定，色谱图见图2，结果见表2。

图2 混合对照品和样品的HPLC图

表2 样品含量测定结果（n＝3）

3 讨论

3.1 指标性成分的选择 本课题组在前期实验中，采用LC-ESI-MSn方法，结合对照品，比较相对保留时间和特征碎片，对菟丝子中的成分进行了结构定性[12]，在定性过程中发现，紫云英苷和槲皮苷结构式相近（见图1），紫云英苷的分子量和槲皮苷的分子量一样，均为448，且二者的出峰时间一样，但是在碎片离子中并未发现m/z303，而是m/z287，因此确定菟丝子中含有紫云英苷，不含槲皮苷。而以往有文献把紫云英苷误认为槲皮苷进行测定是不正确的。因此本实验选择金丝桃苷、紫云英苷、槲皮素、山柰酚、异鼠李素为指标性成分，同时使用金丝桃苷和紫云英苷同时作为指标性成分。

3.2 提取方法的优化 实验中考察了超声提取和加热回流两种方法对菟丝子中5种黄酮类成分含量的影响，发现加热回流对异鼠李素的提取效率明显优于超声提取；同时对溶剂浓度（100%、80%）和加热回流时间（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）进行了考察。最终确定80%甲醇50 mL，加热回流2 h提取效果最好。

3.3 样品含量测定结果比较 从样品的含量测定结果可以看出中药菟丝子中黄酮苷的含量要大于苷元的含量，而菟丝子中以金丝桃苷含量最高，南方菟丝子中以紫云英苷的含量最高；目前的文献报道[13-16]，紫云英苷具有良好的药理活性，同时菟丝子中紫云英苷含量也比较高，而现行的药典中对菟丝子含量测定中仅规定了金丝桃苷的含量不得少于0.10%，有待继续完善和提高。

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（2013-08-26收稿 责任编辑：王明）

Study on Simultaneous Determination of Five Kinds of Flavonoids in Seed of Semen Cuscutae by HPLC

Xu Xiaojia，Xu Liyuan，Guo Zhiyong，Pan Lili，Yuan Shaoxiong，Hao Bian，LV Jianbo，Li Xiangri
（School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

Objective：To determine the content of five kinds of flavonoids in the seed of semen cuscutae，including hyperoside，astragalin，quercetin，kaempferol and isorhamnetin.Methods：The HPLCmethod was used to determine the contentof flavonoids in the seeds of semen cuscutae.The analysis was carried out on Agilent TC C18 column（250 mm×4.6 mm，5μm），with MeOH-0.4% H3PO4asmobile phase，the flow rate of1mL·min-1and wave length at360 nm.The gradientelute time was0→60min→80min，and the proportion ofmethanol was 25%→40%→60%.at45℃.Results：Chromatographic peak separation was in good condition，and five kinds of flavonoids had good linear relationship respectively within their own scope of concentration；the recovery was 98.0%～98. 0%，RSD was 1.44%～2.63%.Conclusion：The established method is simple，accurate，and reproducible and can be used as the quality evaluation of semen cuscutae.

HPLC；Semen cuscutae；Flavonoids

R284.2

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.029

国家自然基金项目（编号：81274081）

李向日（1972.11—），女，教授，博士生导师，主要研究方向为中药炮制与质量控制研究，Tel：（010）84738616，E-mail：lixiangri＠sina.com