补肾通督胶囊对RA患者Th17/Treg平衡影响的研究

朱阳春王英旭林 琳侯丽萍

（1北京中医药大学，北京，100029；2太原市类风湿病医院，山西，030060）

临床研究

补肾通督胶囊对RA患者Th17/Treg平衡影响的研究

朱阳春1王英旭2林 琳1侯丽萍1

（1北京中医药大学，北京，100029；2太原市类风湿病医院，山西，030060）

目的：观察补肾通督胶囊对肾虚寒凝型类风湿性关节炎患者外周血Th17/Treg细胞及血清白细胞介素17A（IL-17A）、转化生长因子-β1（TGF-β1）、IL-10的影响。方法：入选类风湿性关节炎患者随机双盲分为治疗组（36例）和对照组（35例），治疗组口服补肾通督胶囊，对照组口服雷公藤多苷片，均服药12周，采用流式细胞术观察比较治疗前后两组患者外周血Th17/Treg及采用酶联免疫吸附法（ELISA）观察血清IL-17A、TGF-β1、IL-10的变化。结果：治疗后两组与各自治疗前相比，Th17及Th17/Treg显著降低（P＜0.01），Treg显著升高（P＜0.01）；治疗后两组间比较无统计学意义（P＞0.05）。治疗后两组与各自组治疗前相比，IL-17A显著降低（P＜0.01），TGF-β1、IL-10显著升高（P＜0.01）；治疗后两组间比较，治疗组TGF-β1与IL-10升高更加明显（P＜0.01），IL-17A无统计学意义（P＞0.05）。结论：补肾通督胶囊可以明显降低肾虚寒凝型类风湿性关节炎患者外周血Th17/Treg水平，降低血清IL-17A含量，而使血清TGF-β1、IL-10含量升高。

补肾通督胶囊；类风湿性关节炎；Th17/Treg；IL-17A；TGF-β1；IL-10

类风湿性关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种慢性、进行性、系统性自身免疫病，以对称性的外周关节持续性滑膜炎为主要特征，我国初步调查该病发病率约为0.32%～0.36%[1]。RA的发病机制尚未全完清晰，其症状与病情的进展与免疫失衡密切相关，主要表现为Th1/Th2比例失衡。随着对RA发病机制的不断深入研究发现Th17/Treg免疫失衡导致了持续的局部关节炎症，造成对骨及软骨的侵袭破坏，最后导致关节强直、畸形、功能丧失[2]。辅助性T细胞17（T help cell 17，Th17）主要功能为介导炎症反应，通过释放白细胞介素17（IL-17）、白介素22（IL-22）等细胞因子，吸引炎性趋化因子和致炎因子聚集在正常细胞周围[3]，IL-17还可以与其他致炎信号分子协同作用，增强致炎效应[4]。调节性T细胞（Regulatory Tcell，Treg）是一类特意性表达叉头状转录因子家族蛋白3（Forkhead box protein 3，Foxp3），包括天然的T调节细胞和可诱导的T调节细胞。天然Treg的抑制机制主要是细胞接触依赖性及细胞因子非依赖性，而获得性Treg的抑制机制不依赖于细胞间接触而是依赖细胞因子的作用[5]，如转化生长因子-β1（TGF-β1）、IL-10等途径发挥抑炎和维持自身免疫耐受的作用[6]。CD4+CD25+Treg属于天然调节T细胞，而Tr1和Th3属于获得性调节性T细胞[7]。与正常人相比，RA患者外周血CD4+T细胞中，Th17比率上升，而Foxp3+CD+CD25+Treg细胞比率降低，Th17/Treg细胞免疫失衡，向Th17方向偏移[8]。本文从分子水平出发，探讨了补肾通督胶囊对中医辨证属肾虚寒凝型的RA患者外周血Th17/Treg细胞及分泌的细胞因子的影响。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集2012年11月至2013年9月太原类风湿病医院符合纳入标准的RA患者。根据随机数表，按1∶1比例随机双盲分为补肾通督胶囊治疗组和雷公藤多苷片对照组，共收入患者74例，脱落3例，最终完成71例。治疗组36例，男性8例，女性28例；年龄28～65岁，平均（54.08±8.25）岁；病程18～335个月，平均（106.00±83.44）个月。对照组35例，男性8例，女性27例；年龄24～63岁，平均（51.23±9.83）岁；病程24～300个月，平均（119.47±88.43）个月。两组性别、年龄、病程经统计学处理，无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 诊断标准 西医诊断标准参照美国风湿病学会及欧洲抗风湿联盟2010年共同制定的《类风湿性关节炎诊断及治疗指南》[9]，中医诊断及辨证分型标准参照2008年中华中医药学会《中医内科常见病诊疗指南·中医病证部分》[10]及参照1994年国家中医药管理局《中医病证诊断疗效标准》[11]中尪痹的肾虚寒凝型。

1.3 纳入标准 年龄在18～65周岁之间，符合美国风湿病学会及欧洲抗风湿联盟2010年RA诊断标准，X线分期处于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期，中医辨证为肾虚寒凝型。

1.4 排除标准 1）目前正在参加或在本研究前1个月内参加过其他治疗RA临床研究。2）近期准备生育，或处于孕期或哺乳期女性。3）长期服用糖皮质激素治疗RA，且在本研究前至少1个月内未停用药物。4）合并有心血管、肺部、肝脏、肾脏、造血系统等严重疾病。5）重叠其他风湿病如系统性红斑狼疮、干燥综合征、严重的膝骨关节炎等。6）合并严重关节外表现如高热不退、间质性肺炎、肾脏淀粉样变、缩窄性心包炎、中枢神经系统血管炎等，需要使用糖皮质激素治疗。7）伴有活动性胃肠道疾病，或本项研究前30 d内有食物或消化道溃疡。

1.5 脱落标准 1）患者依从性差，中途停止治疗者；2）发生严重并发症，研究无法继续者；3）病情严重恶化，必须采用其他治疗者；4）受试者不能坚持治疗者。

2 方法

2.1 治疗方法 治疗组口服补肾通督胶囊（太原市类风湿病医院院内制剂，药物组成：熟地黄、鹿角、肉桂、芥子、制马钱子、麻黄），3次/d，3粒/次，饭后温水送服；对照组口服雷公藤多苷片，3次/d，1片/次，饭后温水送服。两组疗程均为12周。

2.2 检测方法 两组患者在用药前及用药12周后，于清晨空腹抽取外周血15 mL，其中10 mL加入肝素钠抗凝管中，使用淋巴细胞分离液分离外周血淋巴细胞后，置于1 640培养液、胎牛血清和刺激剂中培养4 h，平均分成2份，分别按试剂盒说明书步骤进行破膜和固定，一份过程中加入PerCP-Cy5.5-CD4抗体、PE-IL-17A抗体；另一份过程中加入FITC-CD4抗体、APC-CD25抗体、PE-FoxP3抗体。之后分别使用BD FACSCalibur流式细胞仪检测其荧光反应，采用BD Cell Quest软件分析测定Th17/Treg的比值；另5 m L加入2%乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，离心后收集血清，-80℃保存。采用酶联免疫吸附法（ELISA）检测IL-17A、TGF-β1、IL-10含量。

2.3 主要试剂及实验仪器 BD FACSCalibur流式细胞仪（BD，美国）；酶标仪DENLEY DRAGON Wellscan MK 2（Thermo，芬兰）使用Ascent software for Multiskan软件进行分析；洗板机为Wellwash 4 MK2（Thermo，芬兰）。

牛的II型胶原（Sigma，美国）；人淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；PerCPCy5.5-CD4抗体（BD，美国）；PE-IL-17A抗体（BD，美国）；FITC-CD4抗体（BD，美国）；APC-CD25抗体（BD，美国）；PE-FoxP3抗体（BD，美国）；IL-17A、TGF-β1、IL-10酶联免疫吸附法试剂盒（山西普兴生化有限公司）。

2.4 统计方法 应用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有结果均以（±s）表示，采用t检验。

3 结果

3.1 流式细胞术检测外周血Th17/Treg 治疗后两组与各自治疗前相比，Th17及Th17/Treg显著降低（P＜0.01），Treg显著升高（P＜0.01）；治疗后两组间比较无统计学意义（P＞0.05）。

表1 两组治疗前后Th17/Treg细胞在CD4+T细胞中的表达情况（±s）

表1 两组治疗前后Th17/Treg细胞在CD4+T细胞中的表达情况（±s）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别例数例时间Th17（CD4+ IL-17A+，%）Treg（CD4+CD25 +FoxP3+，%）Th17/Treg治疗组36治疗前3.74±1.521.21±1.605.13±2.68治疗后2.07±1.76**4.47±2.81**0.89±0.99**对照组35治疗前3.81±1.801.16±1.595.40±3.83治疗后2.49±2.00**3.68±2.86**1.38±2.25**

图1 两组治疗前后Th17/Treg在CD4+T细胞中的表达情况

图2 治疗组Th17/Treg的典型图例

3.2 ELISA检测血清IL-17A、TGF-β1、IL-10 治疗后两组与各自组治疗前相比，IL-17A显著降低（P＜0.01），TGF-β1、IL-10显著升高（P＜0.01）；治疗后两组间比较，治疗组TGF-β1与IL-10升高更加明显（P＜0.01），IL-17A无统计学意义（P＞0.05）。

表2 两组治疗前后血清IL-17A、TGF-β1、IL-10含量（±s）

表2 两组治疗前后血清IL-17A、TGF-β1、IL-10含量（±s）

注：与本组治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与对照组治疗后比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。

组别例数时间IL-17A（pg/mL）TGF-β1（pg/mL）IL-10（pg/mL）治疗组36治疗前34.78±3.8117.94±1.2417.15±2.51治疗后20.14±3.80**28.15±4.70**△△24.69±4.00**△△对照组35治疗前34.94±2.9618.35±1.1217.62±4.05治疗后21.61±2.71**25.15±2.21**21.49±2.47**

4 讨论

RA是一种以慢性的自身免疫性疾病，其主要病理改变为关节滑膜的慢性炎性反应，造成骨、软骨及关节周围组织的破坏。RA发病率居自身免疫性疾病的首位[12]，未经治疗的RA患者2年致残率达50%，3年致残率达70%，大约有一半的RA患者最终因致残丧失劳动能力[13]。

现代医学对RA的发病机制尚未明确，一般认为是感染引起的遗传易感个体的自身免疫反应。Th17细胞亚群是介导自身免疫性疾病的中药群体。Th17细胞分化并且产生的IL-17是一种强大的前炎性细胞因子，可以诱导RA患者核因子κB受体活化因子配体（RANKL）表达，诱导破骨细胞祖细胞向成熟破骨细胞分化，使破骨增加而成骨减少，造成对关节骨与软骨的侵蚀破坏[14]；还可以产生IL-17F/IL-17A蛋白异二聚体，从而促使T细胞介导的免疫应答[15]。可诱导的T调节细胞一种在TGF-β1的诱导下，分化为表达Foxp3的Treg，另一种不表达Foxp3，形成以IL-10高表达为标志的Treg细胞[16]。IL-10能够抑制促炎性细胞因子如TNF-α、IL-6、IFN-γ的生成，可以明显延缓滑膜炎性反应的进展[17]。TGF-β1在低浓度时与IL-6协同作用，促进Th17的分化[18]；在高浓度状态下上调Foxp3的表达，促进Treg细胞的产生，抑制炎性反应形成并防止自身免疫性疾病的产生[19]。有研究表明，在RA发病时，血液中的TGF-β1可以游离至组织中，使血液中TGF-β1降低[20]。可见Th17细胞和Treg细胞在分化上具有相互排斥的信号通路，在功能上相互抑制，Th17/Treg细胞比率的平衡对维持正常免疫应答及防止自身免疫具有重要意义。

补肾通督胶囊是由阳和汤化裁而来，主要成分为熟地黄、鹿角胶、肉桂、芥子、制马钱子、麻黄等。全方辛散滋补同伍，通中有补，扶正与祛邪兼顾，以达到补肾通督、化瘀散结消肿的作用。从药理学方面分析，本方具有较好的消炎镇痛、免疫调节和改善骨破坏的作用。方中熟地黄可以提高免疫器官的增长指数，增强巨噬细胞的吞噬能力[21]；鹿角胶可以显著增加成骨细胞数量，降低骨转化，提高骨质量[22]；马钱子具有显著的镇痛消炎作用，还可以对免疫功能进行双向调节[23]。前期的研究显示补肾通督胶囊对于中医辨证属于肾虚寒凝型的RA有着确切的临床疗效[24]。肾虚寒凝型RA为临床常见证型，主要表现为关节疼痛肿胀，晨僵，活动不利，畏寒怕冷，神倦懒动，腰背酸痛，俯仰不利，天气寒冷加重，舌淡胖，苔白滑，脉沉细。

本研究表明，补肾通督胶囊可以明显降低RA患者外周血Th17细胞比率（P＜0.01），而使Treg细胞升高（P＜0.01），使Th17/Treg向Treg方向偏移，纠正RA患者的免疫偏移。在Th17/Treg的调节上，与对照组雷公藤多苷片相比较，没有统计学意义（P＞0.05）。在细胞因子调节方面，可以使血清中的IL-17A浓度显著降低，而TGF-β和IL-10显著升高（P＜0.01）；与对照组相比，使TGF-β和IL-10升高的作用要明显优于雷公藤多苷片（P＜0.01），而IL-17A的调节没有统计学意义（P＞0.05）。本研究的对照组药物雷公藤多苷片是缓解RA病情的有效药物，其主要成分为雷公藤甲素，具有抗炎、免疫抑制、糖皮质激素样作用作用[25]，可以改善RA患者的病情。但是雷公藤多苷片的有效成分，也是它的毒性成分，容易发生不良反应。2012年4月国家药品不良反应监测中心公布了2004年至2011年9月雷公藤片不良反应病例报告201例，其中严重者19例（9.5%），主要表现为药物性肝炎、肝肾功能异常、肾衰竭、胃出血、白细胞减少、血小板减少、闭经等[26]。雷公藤多苷片，对于RA病情的控制疗效确切，但不宜耐受且不能长期应用，在应用上有明显的局限性。

以Th17/Treg为靶点研究RA越来越受到人们的关注，但目前此类研究大多围绕动物模型展开。而本项研究表明，补肾通督胶囊在调节Th17/Treg方面与雷公藤多苷片没有统计学意义，对于个别相关细胞因子的作用甚至更有优势，而且安全性更高，在治疗肾虚寒凝型RA上有一定的优势，有着更广阔的开发空间，是中医药在治疗RA方面的重要应用，但其作用机制与有效靶点有待于进一步深入研究。

[1]中华医学会风湿病学分会.类风湿关节炎诊治指南（草案）[S].中华风湿病学杂志，2003，7（4）：250.

[2]Mai J，Wang H，Yang XF.Th 17 cells interplay with Foxp3+Tregs in regulation of inflammation and autoimmunity[J].Front Biosci（Landmark Ed），2010 Jun 1，（15）：986-1006.

[3]Figueroa-Vega N，Alfonso-Pérez M，et al.Increased circulating proinflammatory cytokines and Th17 lymphocytes in Hashimoto＇s thyroiditis[J].JClin Endocrinol Metab，2010 Feb，95（2）：953-62.

[4]Kolls JK，Lindén A.Interleukin-17 family members and inflammation[J].Immunity，2004 Oct，21（4）：467-76.

[5]Lawson C A，Brown A K，Bejarano V，et al.Early rheumatoid arthritis is associated with a deficit in the CD4+CD25high regulatory T cell population in peripheral blood[J].Rheumatology，2006，45（10）：1210-1217.

[6]Lawson C A，Brown A K，Bejarano V，et al.Early rheumatoid arthritis is associated with a deficit in the CD4+CD25high regulatory T cell population in peripheral blood[J].Rheumatology，2006，45（10）：1210-1217.

[7]Lawson C A，Brown A K，Bejarano V，et al.Early rheumatoid arthritis is associated with a deficit in the CD4+CD25high regulatory T cell population in peripheral blood[J].Rheumatology，2006，45（10）：1210-1217.

[8]牛倩，黄卓春，蔡蓓，等.类风湿性关节炎患者外周血Th17/Treg细胞比率失衡的研究[J].细胞与分子免疫学杂志，2010（003）：267-269.

[9]Daniel Aletaha，Tuhina Neogi，et，al.2010 Rheumatoid Arthritis Classification Criteria[J].Arthritis＆Rheumatism，2010，62：2569-2581.

[10]中华中医药学会.中医内科常见病诊疗指南·中医病证部分[S].北京：中国中医药出版社，2008，129-131.

[11]国家中医药管理局.中医病证诊断疗效标准[S].北京：1994，47.

[12]张品南，陈艳梅.类风湿关节炎的研究进展[J].中华临床医师杂志：电子版，2008，2（11）：59-61.

[13]Rugiene R，DadonieneJ，Venalis A，et al.Comparison of health-related quality of life between patients with rheumatic diseases and a control group[J].Medicina，2005，41（7）：561-565.

[14]秦霞，刘钟滨.白细胞介素17家族[J].同济大学学报：医学版，2003，24（6）：519-522.

[15]Wright JF，Guo Y，Quazi A，et al.Identification of an interleukin 17F/17A heterodimer in activated human CD4+T cells[J].Journal of Biological Chemistry，2007，282（18）：13447-13455.

[16]牛磊，蒋瑾瑾.Th1/Th2，Th17/Treg平衡与幼年特发性关节炎[J].临床儿科杂志，2010，28（011）：1095-1098.

[17]Jiang JL，Peng Y P，Qiu Y H，et al.Adrenoreceptor-coupled signaltransduction mechanismsmediating lymphocyte apoptosis induced by endogenous catecholamines[J].Journal of neuroimmunology，2009，213（1）：100-111.

[18]Laurence A，Tato CM，Davidson T S，et al.Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation[J].Immunity，2007，26（3）：371-381.

[19]Weaver C T，Hatton R D.Interplay between the TH17 and TReg cell lineages：a（co-）evolutionary perspective[J].Nature Reviews Immunology，2009，9（12）：883-889.

[20]万磊，刘健，黄传兵，等.新风胶囊对佐剂关节炎大鼠肺功能及Treg，Foxp3，TGF-β1/Smads的作用[J].浙江大学学报：医学版，2013，42（4）：418-425.

[21]李佳，程井军，刘洋洋.原花青素与熟地对小鼠免疫功能的影响[J].中国民族民间医药杂志，2010，19（11）：26-27.

[22]蒙海燕，曲晓波，李娜，等.鹿茸及鹿角胶对去卵巢大鼠骨质疏松症的影响[J].中药材，2009，2（2）：179-182.

[23]王立杰，蔡宝昌，陈军，等.马钱子碱对小鼠免疫功能的影响[J].现代中药研究与实践，2008，22（6）：42-44.

[24]周晓莉，刘秀峰，王英旭，等.补肾通督胶囊治疗类风湿关节炎42例疗效观察[J].山西中医，2012，28（2）：21-23.

[25]李德平，翟华强，曹炜，等.雷公藤的药性文献回顾及其作用机制研究进展[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（13）：299-303.

[26]肖廷超，朱必越.雷公藤片的临床应用及不良反应文献分析[J].重庆医学，2013，42（9）：1007-1009.

（2013-11-27收稿 责任编辑：曹柏）

Study on Effect of Bushen Tongdu capsule on Peripheral Th17/Treg Ratio of Patients with Rheumatoid A rthritis

Zhu Yangchun1，Wang Yingxu2，Lin Lin1，Hou Liping1
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China；2 Taiyuan city class rheumatism hospital，Shanxi030060，China）

Objective：To investigate the effectof Bushen Tongdu capsule on peripheral Th17/Treg ratio and serum IL-17A，TGF-β1 and IL-10 of patients with rheumatoid arthritis（RA）.Methods：RA patients were divided randomly and double-blinded into treatment group（n＝36）that were treated with Bushen Tongdu capsules and control group（n＝35）that were treated with Tripterygium glycosides tablets.Patients in both groups were treated for12 weeks.The changes of peripheral blood Th17/Treg ratio and serum IL-17A，TGF-β1 and IL-10 were observed by flow cytometry and ELISA in patients of both teams before and after the treatments.Results：After treatments，Peripheral Th 17%，Th17/Treg ratio significantly decreased and Treg%significantly evaluated（P＜0.01）in both groups，and there was no statistically significant difference between the two groups after the treatments（P＞0.05）.After treatments，the level of serum IL-17A significantly decreased，and TGF-β1 and IL-10 significantly evaluated in both groups（P＜0.01）.Comparing the two groups，TGF-β1 and IL-10 evaluated more in treatment group（P＜0.01），while there was no statistically significant difference between the two groups on the changes of IL-17A（P＞0.05）.Conclusion：Bushen Tongdu capsule can reduce RA patients｀peripheral Th17/Treg ratio and serum IL-17A content，and it also can evaluate serum TGF-β1 and IL-10 content.

Bushen Tongdu capsule；Rheumatoid arthritis；Th17/Treg；IL-17A；TGF-β1；IL-10

R255.9；R259

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.013

山西省科技攻关项目（编号：20120313025-8）

侯丽萍，Tel：13681214238，E-mail：houli＿ping＠163.com