肺与大肠LPS信号通路相关性的实验研究

刘 絮 刘晓燕 郭霞珍

（北京中医药大学，北京，100029）

肺与大肠LPS信号通路相关性的实验研究

刘 絮 刘晓燕 郭霞珍

（北京中医药大学，北京，100029）

目的：研究肺与大肠LPS信号通路变化的相关性。方法：将实验大鼠随机分为生理组、高氧组、低氧组、限食组和限水组，通过测定肺与大肠中TLR4、MD2和CD14的变化观察肺与大肠LPS信号通路的相关性。结果：高氧组和低氧组中肺部TLR4和MD2增高时，肠部也有所增高（P＜0.05），限食组和限水组中肠部TLR4和MD2增高时，肺部亦有增高（P＜0.05）。结论：可以认为肺与大肠在LPS信号通路TLR4和MD2中有相关的协同识别。

肺与大肠；LPS；TLR4；MD2；CD14

细菌内毒素脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）是革兰阴性菌细胞外膜的主要成分，也是免疫和炎症反应细胞的强大激活剂，是革兰氏阴性细菌主要的致病成分，可刺激几乎所有的真核细胞发生形态、代谢和基因表达变化，导致宿主细胞因子失控性表达，介导严重感染，多脏器损伤，败血症休克等多种疾病的发生发展[1]。因此，LPS介导的信号转导机制已成为一个广泛注意的研究领域，近年来已取得实质性的进展。

本实验主要是研究肺与大肠LPS信号通路变化的相关性，肺与大肠是否具有相同的LPS的受体识别模式：ToU样受体4（ToU Like Receptor，TLR4）、髓样分化蛋白-2（Myeloid Differential Protein-2，MD2）和CD14协同识别。

1 材料与方法

1.1 材料 材料健康雌性SD大鼠，体重180～200 g，共50只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。代谢笼式可变氧饲养箱，自主设计，由凌云博际（北京）科技有限公司代为加工生产。测氧仪：数字式测氧仪，北京精微恒氧技术开发中心。天平：DT系列电子天平，北京天平物华医疗仪器有限责任公司。实验用气体：40 L瓶装氧气与氣气，北京朝红平气体有限公司提供。TLR4、MD2和CD14试剂盒由北京瑞格博科技发展有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 生理组大鼠模型 生理组大鼠不做任何处理，正常于代谢笼中喂养。7日后取材。

1.2.2 高氧组大鼠模型 随机选取9只雌性SD大鼠放置于可变氧词养箱中喂养，以10 L/min输入氧气，当氧气浓度达到40%后，持续输入氮气1～2 L/min使氧浓度维持在（40%±3）%，用数字式测氧仪监测箱内氧浓度。每天给予8 h高氧刺激。温度保持在25℃，湿度40%～60%，大鼠自由摄取食物和水。7日后取材。

1.2.3 低氧组大鼠模型 随机选取9只雌性SD大鼠置于可变氧饲养箱中，以10 L/min输入氧气，当氧浓度达到10%后，持续输入氮气1～2 L/min，使氧浓度维持在（10%±1%），用测氧仪监测箱内氧浓度。每天给予8 h低氧刺激。温度保持在25℃，湿度40%～60%，大鼠自由摄取食物和水。7日后取材。

1.2.4 限食组大鼠模型 随机选取9只雌性SD大鼠置于代谢笼中单笼饲养，连续7天测量正常的进食量和进水量，之后按日平均进食量的50%给予喂养，饮水量不变。温度保持在25℃，湿度40%～60%。7 d后取材。

1.2.5 限水组大鼠模型 随机选取9只雌性SD大鼠置于代谢笼中单笼饲养，连续7天测量正常的进食量和进水量，之后按日平均进水量的50%给予喂养，进食量不变。温度保持在25℃，湿度40%～60%。7 d后取材。

1.2.6 指标测定 大鼠造模7日后取材，腹主动脉取血后，迅速剪取肺、空肠、回肠、结肠组织，生理盐水洗涤后，置于液氮罐中，后放置于-40℃冰箱保存。TLR4、MD2和CD14均用试剂盒进行检测。

1.2.7 统计学方法 应用SPSS 17.0进行统计学处理，组间比较采用方差分析，P＜0.05有统计学意义。

2 结果

（见表1、表2、表3）。

2.1 生理现象 生理组和高氧组：大鼠在造模及取材过程中状态良好，没有显著变化。低氧组：在造模过程中发现大鼠体重逐渐减轻，嗜睡，反应迟钝。限食组：在造模过程中大鼠身体逐渐消瘦，造模三四日后易激惹。限水组：取材时发现大鼠结肠中粪便较多，便质坚硬。

2.2 CD14 肺和回肠：与生理组比较，其他各组组织上CD14差异均无统计学意义（P＞0.05）。空肠：高氧组组织上CD14较生理组增高，其他各组均下降（P＜0.05）。结肠：与生理组比较，其他各组组织上CD14均下降（P＜0.05）。可以认为肺与大肠CD14各组之间无比较意义。

2.3 TLR4 回肠：与生理组比较，其他各组组织上TLR4差异均无统计学意义（P＞0.05）。结肠：限食组组织上TLR4较生理组降低（P＜0.05），其他各组与生理组比较均无统计学意义（P＞0.05）。空肠：与生理组比较，其他各组组织上TLR4均有增高（P＜0.05），按其大小排序，限水组＞高氧组＞低氧组＞限食组。肺：与生理组比较，其他各组组织上TLR4均有增高（P＜0.05），按其大小排序，限水组＞高氧组＞限食组＞低氧组。

2.4 MD2 回肠：与生理组比较，其他各组组织上MD2差异均无统计学意义（P＞0.05）。空肠：与生理组比较，各组组织上MD2均有变化（P＜0.05），除限水组其他各组均有增高。结肠：与生理组比较，各组组织上MD2均降低（P＜0.05）。肺：与生理组比较，各组组织上MD2均有变化（P＜0.05），除高氧组和低氧组之外其他各组均有增高。

表1 各组大鼠肺、空肠、回肠、结肠组织上CD14的变化（ng/mL，数据统计均用±s表示）

表1 各组大鼠肺、空肠、回肠、结肠组织上CD14的变化（ng/mL，数据统计均用±s表示）

注：与生理组相比，*P＜0.05具有统计学意义。

组别例数肺空肠回肠结肠生理组9 38.59±2.78 3.31±0.64 15.17±5.10 26.72±4.01高氧组9 41.32±5.28 5.10±4.08*16.12±3.44 17.40±4.57*低氧组9 41.80±5.09 3.13±0.46*17.84±3.01 18.96±4.84*限食组9 41.01±3.57 3.12±0.78*13.03±6.06 21.36±5.45*限水组9 39.17±3.71 3.12±0.78*16.31±1.86 18.97±6.08*

表2 各组大鼠肺、空肠、回肠、结肠组织上TLR4的变化（ng/mL，数据统计均用±s表示）

表2 各组大鼠肺、空肠、回肠、结肠组织上TLR4的变化（ng/mL，数据统计均用±s表示）

注：与生理组相比，*P＜0.05具有统计学意义。

组别例数肺空肠回肠结肠生理组9 2.06±0.13 0.16±0.030.87±0.26 1.03±0.15高氧组9 2.23±0.24*0.27±0.20*1.02±0.23 0.84±0.19低氧组9 2.08±0.16*0.18±0.04*1.00±0.33 0.93±0.14限食组9 2.19±0.19*0.17±0.18*0.77±0.35 0.93±0.17*限水组9 2.29±0.16*0.97±0.22*1.05±0.21 0.97±0.22

表3 各组大鼠肺、空肠、回肠、结肠组织上MD2的变化（ng/mL，数据统计均用±s表示）

表3 各组大鼠肺、空肠、回肠、结肠组织上MD2的变化（ng/mL，数据统计均用±s表示）

注：与生理组相比，*P＜0.05具有统计学意义。

组别例数肺空肠回肠结肠生理组9 2.28±0.41 0.13±0.04 0.60±0.25 1.04±0.18高氧组9 2.23±0.19*0.21±0.13*0.85±0.30 0.60±0.14*低氧组9 2.20±0.33*0.15±0.03*0.77±0.29 0.67±0.15*限食组9 2.47±0.21*0.14±0.04*0.61±0.52 0.59±0.22*限水组9 2.70±0.15*0.10±0.05*0.77±0.26 0.77±0.27*

3 讨论

LPS诱导的炎症反应信号传导通路：脂多糖结合蛋白（LPSBinding Protein，LBP）将LPS传递给CD14分子，由CD14介导LPS细胞内传导而使NF-κB激活，诱导促炎细胞因子TNF、白介素、黏附分子等的表达。LPS与血清中sCD14结合，再与细胞膜上的受体结合将信号转导到细胞内。CD14与多种传递信号的跨膜信号受体不同，CD14分子缺乏胞浆区段，因此CD14不能直接和细胞内进行信号交流，尚需其他分子起信号传导作用。研究发现Toll样受体是LPS信号向细胞内传导的门户蛋白。作为LPS的低亲和力受体的TLR4可以转导刺激信号。二者结合即可形成具备高亲和力结合和信号转导功能的受体复合体，将信号转导到细胞内[2]。而MD2是协助TLR4完成LPS信号转导通路的必不可少的因素。研究[3]发现MD2不仅能增强TLR4对LPS的反应性，还能拓宽TLR4对LPS结构的识别范围。MD2可能帮助TLR4识别LPS/LBP/CD14复合物，并将LPS锁定在结合位点上[4]。MD2在TLR4介导的LPS信号通路中具有重要作用。

TLR4在细胞表面与MD2及CD14协同，形成TLR4/MD2/CD14聚合体，共同识别革兰氏阴性菌的脂多糖（LPS）、内源性配体如热休克蛋白（Hsp60、Hsp70）等配体，将其信号传导到细胞内，引起下游信号途径的激活[5]。

在本实验中，通过数据分析可以知道肺病模型中肺部TLR4和MD2增高时，肠部也有所增高，肠病模型中肠部TLR4和MD2增高时，肺部亦有增高。TLR4和MD2的表达在肺与大肠之间是呈正相关关系的，表明肺与大肠在炎症形成及防治中存在紧密的内在联系。可以认为肺与大肠在LPS信号通路是有相关性的，在TLR4和MD2有相关的协同识别，可以为临床实践提供相应的实验数据。

[1]杨一新，李桂源.LPS所介导的信号转导通路研究进展[J].中南大学学报：医学版，2006，31（1）：141.

[2]胡承香，杨清武，吕凤林，等.CD14与TLR4相互作用的实验研究[J].第三军医大学学报，2004，26（10）：882.

[3]李永旺，麻莉.内毒素诱导的TLR4-MD2信号传导通路[J].中国药理学通报，2002，18（2）：121.

[4]钟田雨，刘靖华，蒋勇.髓样分化蛋白-2在识别和转导内毒素信号中的作用[J].生物化学与生物物理进展，2007，34（5）：460-464.

[5]Cararnalhol，Lopes-CarvalhoT，OstlerD，etal.Regulatory T cells selectively express toll-like receptors and are activated by lipopolysaccharide[J]. JExp Med，2003，197（4）：403-411.

（2014-03-11收稿 责任编辑：洪志强）

The Experiment al Study on LPS Signal Path Correlation of Lung and Large Intestine

Liu Xu，Liu Xiaoyan，Guo Xiazhen
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：To study LPSsignal path changesof lung and large intestine.Methods：Micewere random ly divided into physiological group，hyperoxia group，hypoxia group，diet restriction group，water restriction group.The LPS signal path's correlation of lung and large intestine was observed detecting changes of variation of TLR4，MD2 and CD14 in lung and large intestine.Results：When TLR4 and MD2 in the lungs of hyperoxiagroup and hypoxia group increased，they also increased in the large intestines.When TLR4 and MD2 in the large intestines of diet restriction group and water restriction group increased，they also increased in the lungs.Conclusion：Lung and large intestine can be thought to have related synergy identification in TLR4 and MD2 of LPS signal path.

Lung and large intestine；LPS；TLR4；MD2；CD14

R221；R256.1；R332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.007

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（编号：2009CB522706）

刘絮（1989—），女，山东济宁人，在读硕士研究生，中医基础理论。E-mail：liuxu039＠sina.com

郭霞珍（1950—），女，浙江杭州人，教授，主任医师，研究方向：四时五脏阴阳