“通利大肠”对COPD模型大鼠肺组织SP、VIP含量的影响

张天宇 张金超 刘 妙 吴若菡 张淑静 高誉珊 郑丰杰 许 红 李宇航

（北京中医药大学基础医学院，北京，100029；北京中医药大学经方现代应用关键科学问题的基础研究创新团队，北京，100029）

“通利大肠”对COPD模型大鼠肺组织SP、VIP含量的影响

张天宇 张金超 刘 妙 吴若菡 张淑静 高誉珊 郑丰杰 许 红 李宇航

（北京中医药大学基础医学院，北京，100029；北京中医药大学经方现代应用关键科学问题的基础研究创新团队，北京，100029）

目的：观察“通利大肠”对慢性阻塞性肺疾病（COPD）模型大鼠肺组织P物质（SP）、血管活性肠肽（VIP）含量的影响，从神经肽角度探讨COPD“从肠论治”的效应机制。方法：采用熏烟联合气管注射脂多糖复制COPD大鼠模型。50只雄性大Wistar鼠随机分为正常组、模型组、治肠组、治肺组、肺肠同治组。正常组和模型组均灌胃给予生理盐水，治肠组、治肺组、肺肠同治组分别用治肠药（生大黄）、治肺药（生石膏、苦杏仁、瓜蒌皮）、肺肠同治药（生大黄、生石膏、苦杏仁、瓜蒌皮）灌胃，连续7 d。用免疫组织化学法和酶联免疫吸附法检测肺组织中SP、VIP含量。结果：免疫组化结果显示，与正常组相比，模型组大鼠肺组织SP表达较强，而治肠组、治肺组、肺肠同治组表达较弱；VIP在正常大鼠支气管上皮表达较强，模型组表达明显减弱，各治疗组VIP表达明显增强。酶联免疫吸附法结果显示，与正常组相比，SP在模型组肺组织中含量明显升高，VIP含量明显降低（P＜0.01）；与模型组相比，治肠组、治肺组、肺肠同治组肺组织SP含量均明显降低，VIP含量明显升高（P＜0.01或P＜0.05）；与治肺组相比，肺肠同治组肺组织SP含量明显降低（P＜0.05）。结论：通利大肠或治肺基础上增加通利大肠，可调节COPD模型大鼠肺组织神经肽SP、VIP的含量，这可能是COPD“从肠论治”的效应机制之一。

慢性阻塞性肺疾病；神经肽；从肠论治

慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD）是一种具有气流受限特征的疾病，气流受限不完全可逆、呈进行性发展，与肺部对香烟烟雾等有害气体或有害颗粒的异常炎症反应有关[1]。临床和实验研究均发现，慢性阻塞性肺疾病和哮喘急性发作时患者血液、诱导痰中P物质、血管活性肠肽等神经肽的含量、肺组织中其免疫阳性纤维的表达均存在明显异常[2-3]，应用神经肽受体拮抗剂可有效降低气道反应，提高肺功能，改善肺通气功能障碍[4-5]。

通腑泻下法是“肺与大肠相表里”理论指导下“从肠论治”肺病的中医临床常用治疗方法之一，不但可以有效改善肠道功能，同时亦可明显改善呼吸困难和气体交换功能[6]。本课题组前期研究表明，“通利大肠”或治肺基础上增加通利大肠，可增加对气管注射脂多糖加熏烟致COPD模型大鼠肺功能和血气的改善程度[7]，本研究旨在通过观察宣白承气汤拆方对COPD模型大鼠肺组织SP、VIP含量的影响，从神经肽分泌角度探讨从肠论治COPD的效应机制。

1 材料与方法

1.1 药物制备 采用清·吴鞠通《温病条辨·卷二》宣白承气汤（生石膏五钱、生大黄三钱、杏仁粉二钱、瓜蒌皮一钱五分），根据药物功效与归经将其拆分为三组，即治肺组（生石膏15 g，苦杏仁6 g，瓜蒌皮4.5 g）、治肠组（生大黄9 g）、肺肠同治组（生石膏15 g，苦杏仁6 g，瓜蒌皮4.5 g，大黄9 g）。中药饮片购自北京同仁堂药店，经北京中医药大学中医药基础理论与关键技术研究中心鉴定均为正品。依照人单位体重生药量求得大鼠单位体重生药量，并扩大10倍。各组药物分别以蒸馏水煎煮30 min，提取2次，再合并煎液，并将所得药液用双层纱布过滤，水浴加热蒸发浓缩，贮于冰箱中备用。

1.2 动物与分组 清洁级健康Wistar雄性大鼠，50只，体重（200±20）g，购于北京维通利华实验动物公司，合格证号SCXK（京）2009-0011。动物适应性饲养7 d后，采用随机数字表法分为对照组、模型组、治肠组、治肺组和肺肠同治组，每组10只。第22～28 d，各给药组每天1次灌胃给与相应中药，正常组及模型组给予等量自来水灌胃。各组于末次给药后，禁食12 h后，处死取材。

1.3 模型制备 参照文献[8]采用气管注脂多糖加熏香烟方法复制COPD大鼠模型，即在第1 d和第14 d，用1%的戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰卧位固定于大鼠固定板，暴露声门，将18号静脉套管针快速插入气管，拔出针芯，用1 m L注射器注入溶于生理盐水的LPS200μL（1mg/mL），然后将大鼠固定板直立旋转，使LPS能够均匀分布于两肺。正常组注入生理盐水。第2～28 d（第14 d除外）将大鼠置入60 cm ×50 cm×40 cm熏吸箱内，注入大前门牌过滤嘴香烟烟雾，浓度约5%，每天上午、下午各1 h。

1.4 仪器与试剂 动物熏烟箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制。18号静脉套管针（马来西亚制造）。脂多糖（LPS，Sigma公司）；大前门牌香烟（上海烟草公司，烤烟型，焦油量12 mg，烟气烟碱量0.9 mg，烟气一氧化碳量14 mg）。TECAN全波长酶标仪（Thermo，Multiskan MK3）。

兔抗SP抗体（2853711，博士德）、兔抗VIP抗体（Y-07B11B，博士德）；迈新试剂-即用型免疫组化超敏试剂盒（1208319706，福州迈新生物技术开发有限公司）；4%多聚甲醛溶液、0.1 mol/L磷酸缓冲液、二甲苯、石蜡、无水乙醇、柠檬酸抗原修复液、DAB、中性树脂等；大鼠P物质ELISA试剂盒（M27039504，Cusabio），血管活性肠肽ELISA试剂盒（M27039505，Cusabio）。

图1 肺组织SP免疫组化染色×40

图2 肺组织VIP免疫组化染色×40

1.5 样品处理及检测 腹主动脉取血处死，冰上打开胸、腹腔，分离取材肺脏组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，脱蜡，PBS洗5 min×3次，微波抗原修复10 min，PBS洗5 min×3次，加封闭血清室温孵育15 min，加一抗（SP抗体、VIP抗体）4℃过夜，PBS洗5 min ×3次，加二抗37℃孵育20 min，PBS洗5 min×3次，加三抗37℃孵育20 min，PBS洗5 min×3次，DAB显色剂显色，冲洗，脱水，中性树胶封片。

腹主动脉取血处死，冰上打开胸、腹腔，分离取材肺脏组织，液氮速冻，移植-80℃冰箱保存。应用Cusabio公司的生产的ELISA试剂盒，检测肺组织匀浆中SP及VIP含量，严格按试剂盒说明书进行。

1.6 统计方法 数据以均数±标准差表示，并采用SPSS 17.0软件进行统计分析，多组样本均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）；两两比较方差齐者采用LSD（Least-Significant Difference）检验，方差不齐者采用Dunnett'T3检验，两组之间的比较采用独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺组织中SP、VIP免疫组化分析 如图1、图2所示：SP在正常大鼠肺支气管上皮、肺间质中可见表达，模型组较正常组表达增强，与模型组相比，治肠组、肺肠同治组SP表达减弱。VIP在正常大鼠支气管上皮表达较强，模型组表达明显减弱，各治疗组VIP表达明显增强。

2.2 肺组织中SP及VIP含量比较 如表1所示：与正常组相比，模型组肺（1.49±0.37 vs 0.78±0.07）中SP含量明显升高，模型组肺VIP含量（1.06± 0.30vs0.51±0.20）明显降低。与模型组相比，治肠组、治肺组、肺肠同治组肺组织SP含量均明显降低，VIP含量均明显升高。与治肺组相比，肺肠同治组肺组织SP含量明显降低。

表1 各组大鼠肺组织匀浆SP、VIP含量分析（mean±SD）

3 讨论

在“肺与大肠相表里”理论指导下，借助肺与大肠之间特殊联系，中医药采用“肺病治肠法”在哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺炎、急性呼吸窘迫综合证等肺病的防治中常可获得出人意料的临床疗效[6，9]，其效应机制与黏膜免疫、微生态、淋巴循环、内分泌等有关[10-11]。本课题组既往研究也表明“通利大肠”可改善COPD大鼠肺组织的病理形态和肺功能，增强抑制COPD大鼠气道黏液高分泌的作用，促进SIgA分泌，增强呼吸道和肠道黏膜免疫功能，从而进一步改善气道通气及肺功能[12-13]。

神经肽作为一种内源性活性物质，既存在于神经组织，也在肺、肠等外周组织和器官中广泛表达。研究发现：P物质（SP）既与哮喘、慢性阻塞性肺疾病的气道炎症和气道高反应性形成密切有关[14]，同时也能肠道黏液分泌、刺激肠道运动[15]。VIP在胃肠道中含量最高，通过与受体VPAC1、VPAC2相结合，参与肠道舒张，液体分泌等作用[16]，同时也在肺内广泛分泌，发挥支气管舒张、肥大细胞组织胺释放调节等作用[17]。

本研究发现，气管滴注脂多糖加熏香烟制备的COPD大鼠模型肺组织中神经肽SP、VIP均存在异常分泌，表现为SP含量增加、VIP含量减少，提示神经肽SP、VIP的分泌参与了COPD的病理过程。与模型组相比，用生大黄从肠干预后，对肺组织中SP、VIP的分泌具有显著调节作用，表现为SP含量的降低和VIP含量的升高，提示通利大肠有助于调节肺神经肽分泌，进而改善气道黏液高分泌状态和气道平滑肌收缩引起的管腔狭窄；与治肺组相比，在治肺基础上增加通利大肠可进一步减少SP在肺组织中的表达，VIP的含量亦有增加趋势。因此，通利大肠或在治肺基础上增加通利大肠，均能增强抑制COPD模型大鼠肺组织SP分泌、增加VIP分泌作用，从而进一步改善气道通气障碍，提示神经肽分泌调节可能是COPD从肠论治效应产生的作用环节之一，其调控机制有待进一步研究。

致谢：感谢北京中医药大学病理教研室王谦教授在本文形态学方面给予的指导。

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（2014-03-11收稿 责任编辑：洪志强）

Effect of Relaxing Large Intestine Therapy on Contents of SP and VIP in Lung Tissues of Rat Models with Chronic Obstructive Pulmonary Diseases

Zhang Tianyu，Zhang Jinchao，Liu Miao，Wu Ruohan，Zhang Shujing，Gao Yushan，Zheng Fengjie，Xu Hong，Li Yuhang
（School of Basic Medical Sciences，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Objective：To observe the influence of relaxing large intestine therapy on contents of substance P（SP）and vasoactive intestinal peptide（VIP）in ratmodel with chronic obstructive pulmonary disease（COPD）and exp lore the effective mechanism of treating COPD based on relaxing the large intestine from the aspect of neuropeptide.Methods：Ratsmodel of COPD were established through intratracheal injection of LPS combined with cigarette smoking.Fifty Wistar rats were randomly divided in to normal group，model group，intestine group，lung group and lung-intestine group.The normal group and model group were intragastrically given normal saline solution and other groups were treated with corresponding decoction intragastrically for 7 days.The content of SP and VIP were detected by immunohistochemistry and enzyme-linked immunosorbent assay.Results：Immunohistochemistry results showed that compared with control group，SP in lung tissue of model group was abundantly expressed while in lung group and intestine group and lung-intestine group were weakly expressed.VIP in bronchial epithelium of control group was expressed broadly while model group were lower.After treatment，VIP was increased significantly in trial groups.Enzyme-linked immunosorbent assay showed that compared with control group，SP was increased in lung tissue inmodel group while VIPwere decreased significantly（P＜0.01）.Compared withmodel group，SPwas lower in lung group，intestine group and lung-intestine group.VIPwas increased significantly（P＜0.01 or P＜0.05）.Compared with lung group，SPwas reduced significantly in lung-intestine group（P＜0.05）.Conclusion：The expression of SP and VIP were regulated by the therapy of relaxing the large intestine or relaxing the large intestine on the base of treating lung disease.Thismay be one of the mechanisms of why treating from intestine is effective on COPD.

Chronic obstructive pulmonary diseases；Neuropeptide；Treatment based on large intestine

R256.1；R332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.003

国家重点基础研究发展计划（973计划）项目（编号：2009CB522704）

张天宇，硕士研究生，E-mail：zhangtianyu88016＠126.com

李宇航，北京市北三环东路11号北京中医药大学，邮编：100029，电话：（010）64287503，E-mail：liyuhang＠bucm.edu.cn