从溃疡性结肠炎大鼠呼吸道与肠道微生态同步动态变化探讨“肺与大肠相表里”

郑秀丽 杨 宇 王宝家 唐洪屈 周新颖

（成都中医药大学基础医学院四川，成都，610075）

从溃疡性结肠炎大鼠呼吸道与肠道微生态同步动态变化探讨“肺与大肠相表里”

郑秀丽 杨 宇 王宝家 唐洪屈 周新颖

（成都中医药大学基础医学院四川，成都，610075）

目的：观察溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）大鼠在“肠病及肺”过程中呼吸道和肠道微生态的同步动态变化情况，探讨中医“肺与大肠相表里”理论的微生态机制。方法：以三硝基苯磺酸（TNBS）-乙醇相结合的方法诱导实验性大鼠UC模型，分别在造模后第8天、第29天和第50天三个时间点对呼吸道和肠道的需氧菌总数、厌氧菌总数、肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、产气荚膜梭菌、双歧杆菌、乳酸杆菌进行同步检测。结果：UC大鼠出现肠道菌群失调，益生菌数量减少，条件致病菌数量增多。其呼吸道部分菌群同步出现相关变化。造模后第8天，需氧菌总数和葡萄球菌在呼吸道和肠道同步增多，厌氧菌总数和肠杆菌在肠道增多而在呼吸道减少。造模后第29天，需氧菌总数和葡萄球菌在呼吸道和肠道同步减少，厌氧菌总数和肠杆菌在肠道减少而在呼吸道增多；造模后第50天，呼吸道和肠道的需氧菌总数、厌氧菌总数和葡萄球菌在呼吸道和肠道同步增多。结论：肠病大鼠可出现呼吸道菌群的改变，在“肠病及肺”病理传变过程中，肠病大鼠呼吸道和肠道的部分菌群出现同步增多或减少的相关性变化，提示微生态菌群的变化可能是“肠病及肺”的机制和表现形式之一。

UC；肺与大肠相表里；肠病及肺；肠道微生态；呼吸道微生态

1 引言

“肺与大肠相表里”是颇具中医特色的脏腑相关理论之一。肺与大肠经脉络属，生理上相互协调，病理上相互影响（肺病及肠，肠病及肺），治疗上相互为用（肺病治肠、肠病治肺、肺肠同治）。鉴于该理论在生理、病理、临床治疗等方面的重要意义，开展关于“肺与大肠相表里”这一脏腑相关理论的应用基础研究十分必要。

有关溃疡性结肠炎（Ulcerative Colitis，UC）的前期研究发现，该病可以特异性引起肺支气管病损，肺损伤是该病的肠外表现之一[1-2]。本课题组前期研究亦发现[3-5]，UC模型大鼠可出现肺功能减弱和肺组织形态改变，如肺和支气管出现上皮细胞变性、坏死、脱落、管腔内炎性渗出等；从三个时间节点对该模型进行的动态观察发现，“肠病及肺”是否发生，主要取决于肠病的病理损伤程度，肺脏的病理损伤程度，与肠病的病变时间成正比。本研究拟从观察UC大鼠在“肠病及肺”过程中肠道和呼吸道微生态的同步动态变化切入，探讨中医“肺与大肠相表里”理论的微生态机制。

2 材料和方法

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物 SPF级SD雄性大鼠65只，体重（180±20）g，购自成都达硕生物科技有限公司（动物合格证号：scxk（川）2008-24）。

2.1.2 主要药物与试剂 TNBS（SIGMA公司，批号：109k5008）；肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳酸杆菌、葡萄球菌、产气荚膜梭菌、需氧菌、厌氧菌培养基均购自北京陆桥生物科技有限公司。

2.2 实验方法

2.2.1 动物分组 65只大鼠适应性喂养3 d后，随机分为空白对照组（30只）和肠病模型组（35只），分别在造模第8天、第29天、第50天随机抽取模型动物10只处死观察，构成模型1组（肠病第8天组），模型2组（肠病第29天组）和模型3组（肠病第50天组）三组模型。空白对照组亦分别于上述各相应时间点随机抽取10只处死与模型组进行对比观察。

2.2.2 造模 以三硝基苯磺酸（TNBS）-乙醇相结合的方法诱导实验性大鼠UC模型。大鼠以2.4%水合氯醛0.8～1.0 mL/100 g腹腔注射麻醉后，在石蜡油润滑下，经肠道轻缓插入输液管至距肛门8 cm处将100 mg/kg TNBS加入等体积50%乙醇，注入大鼠结肠，然后注入约0.5 m L空气，将大鼠头部向下倾斜45度放置1 min，然后保持平躺自然清醒。空白对照组大鼠按上述方法给予等量生理盐水灌肠。造模3 d后从模型组随机抽取2只大鼠，取结肠组织，做普通光镜下病理形态学观察，确定模型是否复制成功，模型成功标准参照文献[3]。于首次造模后每7 d按上述方法和剂量对模型组大鼠重复造模，直至实验结束。空白对照组大鼠按上述方法给予等量生理盐水灌肠。

2.2.3 标本采集与制备 分别在造模第8天、第29天、第50天随机抽取模型组和同时间点的空白组大鼠各10只进行标本采集。同步收集结肠内容物和支气管肺泡灌洗液，用于肠道菌群和呼吸道菌群的同步检测。结肠内容物的收集方法：2.4%水合氯醛1.0～1.2 mL/100 g腹腔注射麻醉，打开腹腔，剖开结肠，取结肠内容物（粪便）0.1 g，加入稀释液进行10倍稀释备用。支气管肺泡灌洗液的收集方法：暴露气管和肺，结扎左肺，将无菌生理盐水8mL注入右肺，反复冲洗，回抽支气管肺泡灌洗液4～5 mL，放入无菌离心管备用。

2.2.4 标本培养与检测方法 实验标本经10倍系列稀释后，选择适当稀释度接种平板，每稀释度接种2个平行样，每个样每样点种20μL，培养后经鉴定和计数平板上的目标菌落数N1，计算原始样品中的菌落数V。对结肠内容物标本：V（cfu/g粪便）＝50N1×稀释倍数；对支气管肺泡灌洗液标本：V（cfu/m L灌洗液）＝50N1×稀释倍数。再将得到的菌落形成单位（CFU）数据转换成对数值（lg），完成统计运算。肠杆菌、肠球菌、乳杆菌、双歧杆菌和产气荚膜梭菌的检测方法参照卫生部《保健食品检验与评价技术规范》2003版第148 -153页调节肠道菌群功能检验方法；需氧细菌计数以及厌氧细菌计数原理参照GB 4789.2食品微生物学检验之菌落总数测定。

2.2.5 统计学方法 采用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠肠道菌群检测结果 见表1。与空白组比较，肠病模型大鼠第8天肠道需氧总数、肠杆菌和产气荚膜梭菌显著增多（P＜0.05或P＜0.01），而葡萄球菌显著减少（P＜0.05）。肠病模型大鼠第29天肠道葡萄球菌、肠球菌、乳酸杆菌、厌氧总数和产气荚膜梭菌均显著减少（P＜0.05或P＜0.01）。肠病模型大鼠第50天肠道双歧杆菌、乳酸杆菌和产气荚膜梭菌均显著减少（P＜0.05或P＜0.01）。与肠病模型大鼠第8天比较，肠病模型大鼠第29天肠道需氧总数、肠杆菌、肠球菌、乳酸杆菌、厌氧总数和产气荚膜梭菌均显著减少（P＜0.05或P＜0.01）；肠病模型大鼠第50天肠道需氧总数、肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌和产气荚膜梭菌均显著减少（P＜0.05或P＜0.01）。与肠病模型大鼠第29天比较，肠病模型大鼠第50天肠道葡萄球菌和肠球菌均显著增多（P＜0.01）。

3.2 各组大鼠呼吸道菌群检测结果 见表2。与空白组比较，肠病模型大鼠第8天呼吸道厌氧总数显著减少（P＜0.01），葡萄球菌显著增多（P＜0.05）。肠病模型大鼠第29天呼吸道菌群无显著变化（P＞0.05）。肠病模型大鼠第50天呼吸道厌氧总数显著增多（P＜0.05）。与肠病模型大鼠第8天比较，肠病模型大鼠第29天呼吸道需氧总数和葡萄球菌显著增多（P＜0.01），厌氧总数显著减少（P＜0.01）；肠病模型大鼠第50天呼吸道厌氧总数显著增多（P＜0.01）。与肠病模型大鼠第29天比较，肠病模型大鼠第50天呼吸道需氧总数和葡萄球菌显著增多（P＜0.01）。

表1 各组大鼠肠道菌群检测结果比较（±s）

表1 各组大鼠肠道菌群检测结果比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型第8天比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型第29天比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别例数需氧总数 厌氧总数 葡萄球菌 产气荚膜梭菌 肠杆菌 肠球菌 乳酸杆菌 双歧杆菌.71±0.57 5.25±0.44 8.69±0.81 9.04±0.74模型第8天10 8.47±0.47*9.45±0.58 3.15±0.37*8.00±0.60**7.67±0.40**5.76±0.56 8.72±0.45 9.19±0.29模型第29天10 7.31±0.58△△8.59±1.01*△2.65±0.90**4.77±1.22**△△5.63±0.63△△4.46±0.80**△△7.52±1.11**△△8.67±1.13模型第50天10 7.28±0.74△△8.88±0.93 3.81±0.69▲▲5.40±0.87*△△5.98±0.67△△5.26±0.61▲▲7.64±0.76**△△8.14±1.03空白组10 7.76±0.81 9.33±0.35 3.89±0.76 6.38±0.63 5 *△

表2 各组大鼠呼吸道菌群检测结果比较（±s）

表2 各组大鼠呼吸道菌群检测结果比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型第8天比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型第29天比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

.33±0.73 0.22±0.70 0.21±0.68 0.00±0.00模型第8天10 4.04±0.36 0.93±1.02**3.01±0.36*0.00±0.00 0.20±0.33 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型第29天10 2.94±0.56△△2.84±0.53△△1.93±0.44△△0.30±0.65 0.61±0.80 0.00±0.00 0.00±0.00 0.50±0.83模型第50天10 4.24±0.56▲▲3.18±0.52*△△2.80±0.30▲▲0.00±0.00 0.30±0.65 0.00±0.00 0.00±0.00 0.0产气荚膜梭菌肠杆菌肠球菌乳酸杆菌双歧杆菌空白组10 3.83±0.57 2.39±1.07 2.47±0.82 0.16±0.53 0组别例数需氧总数 厌氧总数 葡萄球菌0±0.00

3.3 肠道微生物定植抗力（B/E值）结果 见表3。与空白组比较，模型第8天组和模型第50天组肠道定植抗力显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。与模型第8天比较，模型第29天组和模型第50天组肠道定植抗力显著增强（P＜0.05或P＜0.01）。与模型第29天比较，模型第50天组的肠道定植抗力显著降低（P＜0.05）。

表3 各组大鼠的肠道微生物定植抗力（B/E值）比较（±s）

表3 各组大鼠的肠道微生物定植抗力（B/E值）比较（±s）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型第8天比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型第29天比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

组别例数B/E值10 1.58±0.10模型第8天10 1.20±0.07**模型第29天10 1.55±0.24△△模型第50天10 1.37±0.23空白组*△▲

3.4 各时间点肠道菌群变化曲线 如图1所示。各菌种在各时间点皆出现了变化。除葡萄球菌外，其余各菌种都在模型第8天时增多，到第29天时减少，第50天时又逐步增多。说明肠道菌群在受到肠道疾病影响的作用下，可出现肠道菌群失调，并随着疾病时日的延长，出现肠道菌群的逐步调整变化。

图1 肠道菌群变化曲线

3.5 各时间点呼吸道菌群的变化曲线 如图2所示。肠病时，呼吸道主要出现变化的菌种是需氧总数、厌氧总数、葡萄球菌和肠杆菌。其中变化曲线趋势一致的是需氧总数和葡萄球菌。都是在模型第8天增多，第29天减少，到第50天又增多。此趋势与肠道的同一菌群变化趋势具有一致性。

图2 呼吸道菌群变化曲线

4 讨论

UC是一种以累及结肠黏膜和黏膜下层的浅表性、非特异性炎症为主要表现的消化道疾病，其发病被认为是宿主遗传易感性、黏膜免疫与肠道菌群共同作用的结果，可能与肠道菌群失调、肠黏膜屏障功能缺陷、肠道通透性增高以及肠道内成分诱发的异常免疫反应等因素有关。国内外研究一致表明，与正常人相比，UC患者普遍存在不同程度的肠道菌群失调，肠道菌群的改变与UC起病、复发密切相关，已成为广泛共识[6-8]。

本研究结果显示，UC大鼠出现肠道菌群失调，益生菌减少而条件致病菌增多，与国内外同类研究结论一致。同时，模型大鼠呼吸道部分菌群也出现一定程度的相关变化。造模第8天，需氧总数和葡萄球菌在呼吸道和肠道同步增多，厌氧总数和肠杆菌在肠道增多而在呼吸道减少。造模第29天，需氧总数和葡萄球菌在呼吸道和肠道同步减少，厌氧总数和肠杆菌在肠道减少而在呼吸道增多；造模第50天，呼吸道和肠道的需氧总数、厌氧总数和葡萄球菌在呼吸道和肠道同步增多。可见，当肠病（UC）时，部分肺、肠菌群可出现同步增多或同步减少，或在肠减少而在肺增多，或在肠增多而在肺减少的相关变化，提示肺、肠微生态菌群的变化可能是“肠病及肺”的途径和表现形式之一。

肠道微生物定植抗力是指肠道内源性专性厌氧菌抑制消化道中主要属需氧菌的潜在致病菌群数量的能力，1971年由荷兰微生物学家Van der waaij教授提出[9]。吴仲文和李兰娟等[10-11]研究认为，粪便中双歧杆菌与肠杆菌的数量比值（B/E值）可作为肠道微生物定植抗力指标应用于临床。B/E值大于1表示肠道定植抗力正常，B/E值小于等于1表示肠道定植抗力降低。本研究结果显示，模型第8天大鼠肠道微生物定植抗力（B/E值）显著下降，模型第29天B/E值逐渐恢复至正常状态，模型第50天B/E值略呈下降趋势。提示肠病（UC）发病可直接导致肠道微生物定植抗力（B/E值）下降，引起严重的肠道菌群失调或紊乱，病程中肠道微生态可呈现自我恢复平衡的能力，肠道定植抗力趋于正常，由于病灶不除，随着疾病时间延长，肠道定植抗力亦无法维持趋于正常的状态，定植抗力下降。

本研究初步发现UC大鼠出现肠道微生态改变，可伴随出现呼吸道微生态的同步变化。今后研究尚可借助新一代454高通量测序技术等分子生物学方法，更准确地鉴定菌群，通过样品细菌总基因组DNA的提取及其DNA基因测序技术，更深入地探讨“肠病及肺”病理传变过程中呼吸道和肠道特异相关功能菌的作用机制。

[1]朱立，王新月，杨雪，等.从溃疡性结肠炎大鼠肺损伤看“肺与大肠相表里”的特异性[J].中国中西医结合杂志，2013，33（3）：346-350.

[2]盛益华，王新月，闫昕，等.从溃疡性结肠炎大鼠肺损伤细胞凋亡机制探讨“肺与大肠相表里”[J].世界华人消化杂志，2013，21（13）：1171-1172.

[3]陈小兵，杨宇，唐宇娇，等.“肠病及肺”动物模型的建立研究思路探讨[J].云南中医中药杂志，2012，33（2）：7-9.

[4]杨瞿嘉.基于肠病模型大鼠病理改变及相关炎性因子的变化探讨“肠病及肺”病理传变机制[D].成都：成都中医药大学，2012.

[5]陈小兵.从“肠病”大鼠模型肺与结肠组织的病理形态及其VIP、SP、CGRP的表达探讨“肠病及肺”的分子机制[D].成都：成都中医药大学，2012.

[6]刘力，张欢.肠道菌群失调与溃疡性结肠炎[J].现代中医药，2010，30（2）：45-47.

[7]牛敏，杜艳，缪应雷.溃疡性结肠炎患者肠道菌群分布的研究现状[J].微生物学免疫学进展，2012，40（6）：68-70.

[8]徐佰国，王英凯，王策，等.肠道菌群与溃疡性结肠炎[J].中国老年学杂志，2012，32（12）：2665-2667.

[9]Van derWaaij，D.，J.M.Berghuis，J.E.C.Lekkerkerk-vander Wees. Colonization resistance of the digestive tract in conventional and antibiotic -treated mice[J].J.Hyg，1971，69：405.

[10]吴仲文，李兰娟，马伟杭，等.肠道微生物定植抗力的新指标—B/E值[J].浙江预防医学，2000，12（7）：4-5.

[11]李兰娟.感染微生态学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2012：11-12，31-32，42-43，84.

（2014-03-11收稿 责任编辑：洪志强）

Exploration on the Interior-Exterior Relation Between Lung and Large Intestine from the Perspective of Synchronous Dynamic Change of Microecology of Respiratory and Intestinal Passage of Rats with Ulcerative Colitis

Zheng Xiuli，Yang Yu，Wang Baojia，Tang Hongqu，Zhou Xinying
（College of Basic Medicine，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 610075，China）

Objective：To explore the micro ecological mechanism of the TCM theory“lung and large intestine are exteriorly and interiorly related”via observing the synchronous dynamic change of microecology of respiratory and intestinal passage of rats with ulcerative colitis.Methods：The ulcerative colitis rat models were created by TNBS（trinitro-benzene-sulfonic acid）.We synchronously detected total aerobic bacteria，anaerobic bacteria，enterobacterium，enterococcus，staphylococcus，clostridium perfringens，bifidobacterium and lactobacillus in respiratory and intestinal passage on the 8th day，the 29th day and the 50th day aftermolding.Results：Dysbacteriosis appeared among the ratmodels including probiotics decreased and conditional pathogenic bacteria increased.Meanwhile，part of the respiratory floras of themodel rats also appeared certain relative changes.Aerobe total and staphylococcus synchronously increased both in lung and large intestine on the 8th daywhile anaerobe total and enterobacterium increased in intestine but decreased in lung.Aerobe total and staphylococcus synchronously decreased both in lung and large intestine at the 29th day while anaerobe total and enterobacterium decreased in intestine but increased in lung.Aerobe total，anaerobe total and staphylococcus synchronously increased both in lung and large intestine at the50th day.Conclusion：Ratswith enteropathy also can suffer from changes of respiratory floras.Parts of the respiratory and intestinal floras of rats with enteropathy appear synchronous changes during the process of enteropthy affected lung.Itmay increase or decreased synchronously.Changes in microbial floras can be one of the mechanisms and forms of“enteropathy affected lung”.

Ulcerative colitis；Exterior and interior relation of lung and large intestine；Enteropthy affected lung；Intestinal microecology；Respiratory microecology

R221；R256.1；R332

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2014.04.006

国家重大基础研究发展计划（973计划）项目（编号：2009CB522706）

郑秀丽（1981—），女，博士，讲师，E-mail：zhengxiuli023＠163.com

杨宇（1953—），男，教授，博士生导师，E-mail：yang6666yu＠163.com