胎盘Hofbauer细胞及其hAⅤ表达①

王 健 周 娜 （安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，淮南 232001）

胎盘Hofbauer细胞及其hAⅤ表达①

王 健 周 娜 （安徽理工大学医学院病原学与免疫学教研室，淮南 232001）

胎盘是妊娠期间存在的特有器官，不仅能够实现母体和胎儿间物质交换，还可以通过胎盘屏障抵抗各种侵入胚胎的病原微生物。Hofbauer细胞是胎盘巨噬细胞，位于绒毛间质内，能够捕获和提呈抗原信息，参与母胎免疫反应;其表面表达人膜联蛋白Ⅴ（Human AnnexinⅤ，hAⅤ）等多种受体。hAⅤ是钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族成员，参与细胞内、外多种代谢过程，如细胞信号转导、分化、细胞膜运输、胞吞、胞吐作用等。本文围绕胎盘Hofbauer细胞及其hAⅤ研究进展进行综述，现将结果报道如下。

1 胎盘发育和Hofbauer细胞的形成

1.1 胎盘组织发育 胎盘是孕妇分娩时脱离子宫的附属结构，呈圆盘状，中央较厚，边缘较薄，厚2.0 ～2.5 cm，直径平均约 22 cm，重约 470 g［1］。向着羊膜光滑的一面为子面，可见绒毛组织;另一面较粗糙的为母面（如图1），是胎盘剥离时撕裂断的蜕膜组织，可见黑褐色的小叶或子叶。胎盘是由羊膜、叶状绒毛膜（亦称丛密绒毛膜）和底蜕膜构成。

在妊娠期间，胎盘的细胞成分较复杂，既有滋养层细胞，又有间质细胞、单核巨噬细胞等，通常不含浆细胞，胎盘上皮细胞（滋养层细胞）在多处与免疫细胞直接接触。在胎盘子面，滋养层干细胞在绒毛间质内与Hofbauer细胞相邻;在胎盘母面，入侵的滋养层细胞与母体子宫内NK细胞（CD56 bright）、巨噬细胞和T细胞聚集。胎儿细胞滋养层能够使母体免疫细胞迁移［2］。人类胎盘细胞主要指合体滋养层细胞（Syncytiotrophoblast，SCT）［3］，该细胞位于与母亲血液直接接触的滋养层陷窝内;基质细胞下是胎儿的毛细血管，主要由成纤维细胞（Fibroblasts，FIBs）和Hofbauer细胞或者胎儿组织的巨噬细胞组成。Bui等［4］在探讨齐多夫定（Zidovudine，ZDV）对受HIV感染的胎盘滋养层细胞和Hofbauer细胞影响时，发现滋养层细胞和Hofbauer细胞是胎盘两个主要细胞类型，尽管滋养层细胞仅占胎盘体重的13%，但它是新陈代谢最活跃的细胞。绒毛膜滋养层细胞开始分化成两种类型，合体滋养层细胞、单核滋养层细胞。滋养层细胞融合形成多核滋养层细胞围绕在胎儿毛细血管周围的内皮细胞，单核滋养层细胞排列在靠近母亲外周血的血窦。Hofbauer细胞是胎盘巨噬细胞［5］，分泌血管生成因子（VEGF），参与胎盘早期血管生成;表达多种细胞因子，参与胎盘的免疫反应。

1.2 胎盘Hofbauer细胞结构 150多年前，有学者从人胎盘绒毛中发现Hofbauer细胞，亦称胎盘组织巨噬细胞，其形态为圆形或椭圆形，大小约10～30 μm，单核、偏位，光学显微镜下可见Hofbauer细胞分布在胎盘间质内，个体较大，形状不规则，胞核呈卵圆形，胞浆较多;胞质内含大小不一的空泡和致密颗粒。电子显微镜下见Hofbauer细胞表面有液泡、大的伪状板足、褶壁［6］。Hofbauer细胞在孕早期来源于间质细胞［7］，在孕后期源于胎儿骨髓的单核细胞。受精后18 d，Hofbauer细胞开始出现在绒毛小叶中。妊娠5～6个月数量开始减少，足月时，绒毛小叶间质内的Hofbauer细胞已非常少见。有人认为足月时Hofbauer细胞并未减少，只是由于足月时绒毛小叶间质的密度增加，难以观察到Hofbauer细胞。

1.3 胎盘Hofbauer细胞功能 Hofbauer细胞数量与血管生成有关。在孕早期和中期，多数绒毛不成熟时，Hofbauer细胞存在与基质相连的滋养层和毛细血管中，与胎儿血管生成有关。Hofbauer细胞位于滋养层细胞和胎儿毛细血管［8］，使它们在绒毛膜结缔组织核心更好地参与和调节胎盘生长过程。采用Ficoll和Percoll梯度离心法将Hofbauer细胞从胎盘中分离出来，残留的滋养层细胞使用抗表皮生长因子受体包被免疫磁珠微球黏附法去除。分离出来的细胞鉴别采用抗-CD68免疫组化法染色，其中90%以上的细胞呈阳性，结果显示每20 g的胎盘组织含有Hofbauer细胞达106。

Hofbauer细胞起源于胎盘绒毛膜间质细胞，能够吞噬凋亡和破损的细胞，在炎症和病原微生物入侵时产生抗体，发挥免疫保护作用。其沿着基质通道自由移动，参与基质水分调节、离子的运输和组织液的流动，加强宿主免疫防御作用。Kim等［9］选择妊娠22～42周含有VUE（Villitis of unknown etiology）的胎盘，其产妇无明显临床症状，采用原位杂交和免疫组化法检测，结果显示不明病原体绒毛间质区域中发现少量含CD68、CD14杂交信号的Hofbauer细胞，并伴有 CD4+、CD8+细胞浸润，提示 Hofbauer细胞对防御不明病原体侵入、降低胎盘的炎症病变有重要作用。

2 hAⅤ的结构和功能

2.1 hAⅤ的结构 人膜联蛋白Ⅴ又称ANXA5，是钙离子依赖的磷脂结合蛋白家族成员，广泛分布于各种组织细胞中，具有多种生理功能。Annexin A5由 ANXA5 基因编码［10，11］，位于染色体 4q26-q28，其表面具有亲水基团的水溶性蛋白，由320个氨基酸相互折叠而成四个同源结构域，分子量34 kD，核心蛋白的羧基末端包含四个重复序列，每个羧基端约含有70个氨基酸，（如图2示），该高度保守序列是介导钙离子与磷脂结合、细胞膜脂质双层钙离子通道形成的分子基础，启动子不能识别 TATA区域［12］。迄今为止至少发现12种家族成员，编码序号分别为Ⅰ～Ⅻ，是人类基因图谱NIH/CEPH的一部分。ANXA5含有12个内含子，长约38.5 kb;13个外显子，长约28 kb，编码独特的N末端和核心中高度保守的C端区域。细胞外的膜联蛋白在肾脏、肝脏等器官中丰富表达，但在胎盘中表达水平最高，最初曾被称为“胎盘抗凝蛋白”。1990年 Huber等［13］发现了膜联蛋白晶体结构—Human AnnexinⅤ。含有四个折叠的同源结构域，这四个结构域根据氨基酸序列如下区分:氨基末端:17-88;结构Ⅰ:17-88;结构Ⅱ:89-159;连接区域:160-167;结构Ⅲ168-246;结构Ⅳ:247-317。膜联蛋白家族都具有相同的表面结构和高度相似的α螺旋紧密折叠区域及高度重复序列［14］。A-E五个α螺旋组成一个结构域，A、B、D、E四个平行螺旋位点的轴线与C螺旋近似垂直相连，分子总体是含一个凹面和凸面的平缓曲线。四个结构域平行排列为一组，多肽链的N端和C端相互连接使A～D区域非共价结合。结构域Ⅱ和Ⅲ、Ⅰ和Ⅳ的疏水基团紧密连接在一起产生的两个分子双面对称。在分子的中心亲水基团突起形成一个离子通道，这个通道由ⅡA、ⅡB、ⅣA、ⅣB四个螺旋组成，带有具有高度稳定的极性或带电物质。通过电子密度可以清楚地认识到结构中嵌入的水分子主要位于中心的离子通道中。钙离子结合位点位于膜联蛋白的凸面，凸面含有磷脂和钙离子结合部位，膜结合位点位于折叠内联蛋白内第17个氨基酸序列处。Annexin A5［15］缺乏分泌到外部的5’区域序列，35.7 kD，Huber通过X射线发现Annexin A5可溶性三级结构，其三级结构的核心由四个区域循环排列，这样的排列使分子表面为凹面和凸面稍弯曲形状。凸面与是钙离子结合位点，凹面连接一段短的氨基末端。Annexin A5内部通过非共价相互作用。Annexin A5单体与磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）结合首先形成三聚体其次形成2D晶体模式。在形成的三聚体中Annexin A5的结构域Ⅱ位于内部。Ⅲ、Ⅳ位于外部。2D晶体模式由三聚体、二聚体和三聚体、三聚体和三聚体形成分别对称的低密度P6和高密度P3两种结构。这两种晶体模式的形成取决于细胞膜PS的含量和钙离子密度。从三维结构［16］分析（如图3），膜联蛋白Ⅴ钙离子结合位点可以分为两类，AB和DE循环。AB位点是钙离子和磷脂结合位点及与磷脂酶A2的结合部位。

图1 胎盘的形态结构Fig.1 M orphological structure of placenta

图2 人膜联蛋白Ⅴ蛋白质结构Fig.2 Protein structure of Hum an Annexin V

图3 膜联蛋白Ⅴ的分子结构［16］Fig.3 M olecular structure of Annexin V［16］

2.2 hAⅤ的功能 人Annexin V作为一种细胞内蛋白，缺乏一个疏水信号肽，常存在于培养的内皮细胞、羊水、血小板血浆和活化的血小板中，亦可存在于人滋养层细胞和胎盘绒毛细胞。有学者从肥厚的软骨细胞中发现Annexin V，免疫荧光检测发现其位于微绒毛表面，免疫电镜显示细胞表面碘化。为确定Annexin V是否是从细胞内分泌和释放的，Wang等［17］构建一种转基因cos-7细胞，作用于内质网高尔基体，经典分泌途径作用于氨基酸末端的一个信号肽，通过转染的COS-7细胞确定Annexin V是否分泌信号肽。疏水信号肽序列的缺乏使Annexin V不能通过内质网和高尔基体的加工和处理。当内皮细胞或滋养层细胞受损，胞内Annexin V释放，释放的Annexin V与相邻细胞表面暴露的PS结合，通过带负电荷的磷脂阻止凝血因子的激活。

人annexin V属膜联蛋白家族成员，广泛分布于多种组织，与磷脂酰丝氨酸有很高的亲合力，以Ca2+依赖方式与带负电荷的磷脂结合，并向细胞核或细胞膜移位，参与细胞内、外多种代谢过程，如促有丝分裂信号转导、分化、细胞膜运输、胞吞、胞吐作用等。Annexin V的亲水核心就是离子通道，钙离子结合位点位于Annexin V凸面膜上。细胞内丰富的PS和Annexin-A5与细胞外高浓度的钙离子结合到一起［18］。PS和Annexin-A5结合组装成2D晶体结构暴露在破损细胞膜边缘，触动钙离子聚集。体外研究表明Annexin-A5 2D结构能够固定于单层脂质，减少磷脂层的横向扩散，推测Annexin-A5 2D结构通过抵消由于细胞骨架附着形成的膜张力，促进受损细胞膜的修复，阻止细胞膜进一步破裂。通常情况下，磷脂酰丝氨酸位于细胞膜内部［15］，但在活化血小板、死细胞及一些白细胞中磷脂酰丝氨酸从膜内外翻。膜联蛋白Ⅴ依赖钙离子和外翻的磷脂酰丝氨酸结合形成2D晶体模式。在20世纪70年代末，人们首次从胎盘内分离出hAⅤ，几年后这种蛋白在血管中发现，因为其具有抗凝血功能而被命名为抗凝血蛋白。抗凝机制使hAⅤ与血浆具有较高的亲和力，这个特性使AnxA5能够很好地阻断凝血酶原复合物的活性［x-±s，50%抑制浓度，（16±12）nmol/L］。研究表明［19］膜联蛋白的功能多样，既可以作为一些酶类如酪氨酸酶的底物，又参与胞外分泌，AnnexinⅠ分泌前列腺素参与精子生成及抗凝等作用。另外Annexin V还参与细胞识别和黏附的功能。AnnexinⅤ因在细胞凋亡中的广泛应用而在膜联蛋白中扮演特殊的角色。在细胞凋亡早期的特点是磷脂酰丝氨酸从胞内转移到胞外（外翻），AnnexinⅤ在钙离子介导下与PS磷脂酰丝氨酸结合，选择合适的标记物（荧光、酶、胶体金），可以用于检测细胞凋亡，提示Annexin V对细胞凋亡有促进作用。Annexin V还可用于血小板活化和促凝血机制的研究。胎盘抗凝蛋白 hAⅤ在人体滋养层（SCTs）高表达［20］，hAⅤ在细胞脂质层形成2D晶体结构辅助凝血酶抗凝作用。hAⅤ位于胎盘SCTs的顶层，在绒毛血液循环中发挥重要的抗凝作用（如图4）。在怀孕的小鼠体内注入抗hAⅤ抗体，发现随着孕期的发展和胎儿的生长，胎盘出现坏死和纤维化。已经证实抗磷脂抗体（antiphospholipid，aPL）能够介导hAⅤ表达的减少。调查羟化氯喹（Hydroxychloroquine，HCQ）可以直接影响aPL-h AⅤ血栓形成机制，通过椭圆偏振技术和原子力显像技术显示aPL免疫复合物位于细胞膜磷脂双分子层，羟化氯喹（HCQ）直接阻断aPL免疫复合物的形成和促进h AⅤ的修复。Di Simone等［21］探讨 aANX（anti-annexin V）单克隆抗体与滋养层细胞结合对于人绒毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotrophin，HCG）分泌和细胞凋亡的影响，通过实验发现人滋养层分化过程中的磷脂酰丝氨酸分泌增加，负电荷磷脂酰丝氨酸的暴露为hAⅤ提供结合位点，hAⅤ-磷脂酰丝氨酸复合物增加到一定水平后与aANX抗体结合。aANX识别hAⅤ后，hAⅤ与磷脂的结合减少，从而抑制其抗凝作用。aPL抗体使AnxA5晶体结构中暴露的磷脂产生间隙［22］，并且能够促进血液凝固。在人工磷脂膜和内皮细胞、滋养层细胞等细胞膜中已经证实aPL能够破坏AnxA5的晶体结构。羟化氯喹可以通过以下两种途径阻止aPL的作用:①阻止aPL-IgG糖蛋白复合物的形成;②促进AnxA5晶体破坏区域的修复。

图4 膜联蛋白Ⅴ与磷脂酰丝氨酸结合及其抗凝功能Fig.4 Annexin V binding to phosphatidylserine plays a role of anticoagulation

3 Hofbauer细胞与HBV宫内感染

体外实验证实［23］HBV能够直接吸附于Hofbauer细胞表面，并侵入Hofbauer细胞内进行复制表达，释放出有感染性的病毒颗粒，培养上清液中可检出HBsAg，提示Hofbauer细胞在介导HBV宫内感染中发挥重要作用。HBV-DNA［24］在胎盘母面到胎儿面浓度的减少说明HBV宫内感染的一种可能机制是病毒在胎盘细胞间的转移。胎盘细胞组成一层紧密相连的单层上皮细胞，顶端与母亲血液相接，基底层与胎儿血液循环相连。在孕20周，这些细胞末端经过分化和融合形成合体滋养层细胞，合体滋养层细胞组成胎盘屏障进行母胎物质运输。在孕早期HBV通过胞吞作用穿过胎盘屏障感染胎儿。HBV能够通过囊泡运输跨过滋养层细胞保持传染性。Annexin V是一种细胞内蛋白，常存在于培养的内皮细胞、羊水、血小板血浆和活化的血小板中，亦可存在于人滋养层细胞和胎盘绒毛细胞。Hofbauer细胞是胎盘巨噬细胞，其表面表达Annexin V受体。白桂芹等［25］通过SP法检测30例HBsAg阳性孕妇足月分娩胎盘和20例正常足月胎盘表面hAⅤ的分布和表达，探讨其在乙肝宫内感染中的意义。结果发现实验组和对照组的绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞、毛细血管内皮细胞均可见hAⅤ表达;HBV感染的标本中hAⅤ从母面绒毛滋养层细胞、绒毛间质细胞至胎儿面绒毛毛细血管内皮细胞逐层递减。HBV感染的胎盘组织hAⅤ表达上调，hAⅤ可能作为受体介导了HBV感染胎盘细胞，引发宫内感染。De Meyer等［26］研究表明hAⅤ作为一种钙离子依赖的磷脂结合蛋白，主要表达于人类的肝细胞，不感染鼠类的肝细胞或肝细胞膜，其可与HBsAg特异性结合。鼠源Annexin V和人源Annexin V的氨基酸序列有90%的同源性，但鼠源Annexin V不能有效的结合HBsAg。将含hAⅤ的结构基因转染大鼠肝癌细胞系，可致其表达hAⅤ，并增强对HBV的易感性。当hAⅤ转染原代大鼠肝细胞后，可分别检出HBV的 mRNA、HBV（cccDNA）、复制中间体、HB-sAg、HBcAg和HBV-DNA，而未转染hAⅤ者，未检出病毒复制标志物。Hofbauer细胞表面表达Annexin V受体可能是介导HBV宫内感染的关键受体。

综上所述，Hofbauer细胞作为胎盘的巨噬细胞，通过吞噬凋亡和破损的细胞，在抗炎和抵御病原微生物入侵时发挥保护作用。hAⅤ作为Hofbauer细胞表面的关键受体，以Ca2+依赖方式与带负电荷的磷脂酰丝氨酸结合。hAⅤ亦可作为HBV受体，与病毒表面的S蛋白特异性结合，使病毒通过跨膜转运进入细胞内，介导HBV宫内感染。

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［收稿2013-05-08 修回2013-06-09］

（编辑 倪 鹏）

R392 R715.2

A

1000-484X（2014）05-0708-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.032

①本文为安徽省教育厅自然科学基金项目（No.KJ2008A153）和安徽省自然科学基金项目（No.1308085MH148）。

王 健（1962年-），男，教授，硕士生导师，主要从事病毒感染与免疫方面研究，E-mail:wangjian8237@sina.com。