支原体脂肽经TLR2，6/c-Src/PI3K通路诱导单核细胞表达血红素氧合酶-1①

游晓星 马小华 刘良专 曾焱华 朱翠明 何 军 蒋传好 吴移谋

（南华大学病原生物学研究所，衡阳 421001）

支原体脂肽经TLR2，6/c-Src/PI3K通路诱导单核细胞表达血红素氧合酶-1①

游晓星 马小华②刘良专 曾焱华 朱翠明 何 军③蒋传好 吴移谋

（南华大学病原生物学研究所，衡阳 421001）

目的:观察支原体巨噬细胞活化脂肽2（Macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）诱导人单核细胞系THP-1表达血红素氧合酶-1（Hemeoxygenase，HO-1）的分子机制。方法:体外培养THP-1细胞，用不同浓度的MALP-2作用12 h，Western blot检测HO-1的表达。THP-1细胞经TLR2和TLR6中和抗体孵育，或构建TLR2和TLR6负显性突变体转染细胞，以明确TLR2和TLR6在介导HO-1表达中的作用;Western blot检测c-Src和Akt磷酸化情况，同时，分别采用c-Src siRNA或PI3K抑制剂LY294002处理细胞，观察c-Src及PI3K在HO-1表达中的作用。结果:MALP-2处理后可磷酸化c-Src，而TLR2和TLR6中和抗体以及其负显性突变体转染后，c-Src磷酸化水平显著降低;同时，c-Src siRNA可降低Akt磷酸化水平，而PI3K抑制剂LY294002处理后可明显降低HO-1的表达。结论:MALP-2能诱导THP-1细胞表达HO-1，其机制可能受TLR2，6/c-Src/PI3K通路调控。

支原体巨噬细胞活化脂肽2;血红素氧合酶-1;单核细胞

支原体是一类能引起非典型肺炎、非淋球菌性 尿道炎以及生殖系统炎症等疾病的原核细胞型微生物［1，2］。支原体感染宿主后，首先经单核、巨噬细胞表面的Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）所识别，随后在接头分子MyD88和Mal的介导下，通过IRAK4/IRAK1 和 TRAF6，最终激活 MAPKs、NF-κB和AP-1，并诱导多种炎性细胞因子（如TNF-α，IL-1β和IL-6）及介质（ROS，NO和COX-2）的表达。这些炎症因子和介质构成了复杂的协同或拮抗网络，虽然对清除支原体有利，但这些分子的异常分泌，也是导致免疫功能异常的重要因素［3，4］。既然支原体感染可诱导单核巨噬细胞表达和分泌炎症物质，那么，机体必然存在某种调控机制使炎症反应趋向于稳态，从而避免过度的组织损伤。血红素氧合酶（Heme oxygenase）是催化血红素降解为CO、Fe2+和胆绿素的限速酶［5］，主要有3种异构酶（HO-1、HO-2和HO-3），其中HO-1是诱导型，在各种损伤性刺激下表达增高，又称为热休克蛋白32。研究显示，HO-1及其代谢产物在维护细胞稳态的过程中具有抗炎、抗增殖、抗氧化及抗凋亡等多重作用［6］，HO-1表达的降低或缺失使机体对氧化应激的耐受性降低，从而诱发广泛的氧化性损伤或器官衰竭。在前期的研究当中，本课题组已经证实支原体巨噬细胞活性脂肽 2（Macrophage-activating lipopeptide-2，MALP-2）可经MAPKs途径诱导单核细胞表达HO-1［7］，但其分子机制目前仍不清楚。本研究旨在探讨HO-1表达的分子调控机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 人单核细胞系THP-1细胞购自 ATCC，MALP-2购自 Alexis Biochemicals（ALX-162-027-C050）。鼠抗人 HO-1、p-Akt及 total Akt、pc-Src及total c-Src抗体购自Cell Signaling，TLR2和TLR6中和抗体、DN-TLR2和DN-TLR6负显性突变体质粒购自 InvivoGen。LY294002购自Sigma-Adrich。c-Src siRNA及对照 siRNA购自 Dharmacon。蛋白酶、磷酸酶抑制剂Cocktail购自Roche，细胞蛋白提取试剂盒、蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo，FuGENE6转染试剂购自Roche。

1.2 细胞培养与处理 THP-1细胞用含10%FBS、2 mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，于37℃、5%CO2的恒温细胞培养箱中培养。MALP-2刺激前，THP-1细胞于1 000 r/min离心5min，无菌PBS洗涤后，用含1%FBS的RPMI1640培养液于6孔板中调整其密度为 5 × 105ml－1，37℃，5%CO2继续培养 24 h。随后用MALP-2刺激12 h。

1.3 Western blot检测HO-1表达及c-Src和Akt磷酸化 细胞刺激结束后，用预冷的无菌PBS洗涤，迅速置于冰上，按蛋白提取试剂盒提供的步骤获取细胞总蛋白并测定其浓度。取80μg蛋白加入等体积的2×SDS上样缓冲液煮沸5 min后用于SDSPAGE。随后转印至PVDF膜上，并利用含5%脱脂牛奶的TBST封闭1 h，随后加入一抗4℃孵育过夜。多次洗涤后，加入 HRP标记的二抗孵育膜1 h。ECL法发光、显影。

1.4 瞬时转染负显性质粒及siRNA 约5×104细胞接种于24孔细胞培养板过夜。随后按照Fu-GENE6提供的操作步骤，将DN-TLR2或DN-TLR6质粒，或c-Src siRNA混合物孵育细胞。转染24 h后，用PBS漂洗细胞，并用1%FBS维持24 h后再用MALP-2刺激12 h。

1.5 统计学分析 应用GraphPad Prizm软件进行统计学分析，数据用x－±s表示，并采用单因素方差分析数据，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MALP-2诱导THP-1细胞表达HO-1 Western blot结果显示，0.01 ng/ml MALP-2作用THP-1细胞12 h后，即可明显诱导HO-1表达，且随着MALP-2浓度的增高，HO-1表达逐渐增多。其中5 ng/ml MALP-2处理后，HO-1表达增加了3.2倍，而此时尚未出现细胞毒性作用（MTT结果未显示），见图1。

2.2 TLR2，6介导 MALP-2诱导HO-1产生 THP-1细胞用MALP-2刺激前，分别与不同浓度TLR2或TLR6中和抗体孵育1 h，随后 MALP-2刺激12 h。Western blot结果显示，TLR2和TLR6中和抗体均能有效抑制MALP-2诱导HO-1表达（图2A、B）。此外，THP-1细胞转染TIR区域突变的TLR2负显性突变体（DN-TLR2）或DN-TLR6后，再用MALP-2刺激，结果显示HO-1表达显著降低（图2C、D）。

2.3 MALP-2能诱导c-Src磷酸化 Western blot结果显示，MALP-2作用THP-1细胞3～5 min后即可诱导c-Src（Tyr416）磷酸化，随后随着时间的延长，磷酸化水平逐渐降低。而细胞内总c-Src含量保持不变（图3A）。此外，细胞转染DN-TLR2和DN-TLR6后，磷酸化c-Src显著降低（图3B）。

2.4 c-Src参与HO-1表达 采用siRNA干扰c-Src表达后，再用MALP-2作用12 h，结果显示，HO-1表达显著降低，见图4。

2.5 c-Src诱导Akt磷酸化从而诱导HO-1表达

MALP-2作用THP-1细胞5 min即可诱导PI3K下游产物 Akt磷酸化（图5A）。此外，细胞转染 c-Src siRNA后，磷酸化Akt显著降低 （图5B）。而 THP-1预先经不同浓度PI3K特异性抑制剂LY294002处理后，再用MALP-2刺激12 h，HO-1表达随之降低（图5C）。

图1 MALP-2诱导THP-1细胞表达HO-1蛋白Fig.1 MALP-2 induces THP-1 cells expression of HO-1 protein

图2 TLR2或TLR6介导MALP-2诱导THP-1细胞表达HO-1Fig.2 TLR2 and TLR6 mediates MALP-2 induced HO-1 expression in THP-1 cells

图3 MALP-2诱导THP-1细胞中c-Src磷酸化Fig.3 MALP-2 induces c-Src phosphorylation in THP-1 cells

3 讨论

图4 siRNA干扰c-Src表达抑制HO-1产生Fig.4 c-Src siRNA abrogate HO-1 induction

图5 MALP-2经c-Src/PI3K诱导THP-1表达HO-1Fig.5 MALP-2-induced HO-1 expression ismediated by c-Src/PI3K

支原体缺乏其他细菌的致病物质内毒素，其细胞膜中的脂蛋白是主要的致炎物质［3，4，8］。支原体膜脂蛋白由N-二乙酰半胱氨酸结构和与之结合的多肽组成，其中N端乙酰半胱氨酸是其生物学活性的基础。理论上说提取膜脂蛋白是研究其感染与免疫机制的最佳物质，然而在支原体体外培养以及蛋白提取过程中极易受到内毒素污染，且常规方法难以去除。MALP-2最初是从发酵支原体脂蛋白中分离出的一种脂肽，是活化单核、巨噬细胞最强的刺激物之一，常用于体外模拟支原体脂蛋白刺激或TLR2的激动剂。支原体脂蛋白/MALP-2被单核巨噬细胞识别后，可诱导机体分泌多种炎症因子和介质，这些物质虽然有利于清除支原体，但为了避免炎症失控以及自身凋亡的发生，机体具备多种自我保护机制发挥对炎症的负调控。在前期研究中，本课题组发现MALP-2可诱导THP-1细胞表达和产生HO-1而负调COX-2的过度表达［7］。本研究对其分子机制进行了进一步探讨，结果发现MALP-2诱导HO-1表达是通过TLR2，6/c-Src/PI3K通路而实现的。

TLR2，6是识别支原体的主要受体［9］。本研究采用TLR2和TLR6特异性中和抗体封闭后，HO-1表达明显降低。但单纯的抗体封闭并不能完全体现TLR2和TLR6在介导HO-1表达中的作用，随后采用TIR区域突变的TLR2，6负显性突变体转染THP-1细胞后，也得到了类似的结果，这表明TLR2和TLR6均参与了MALP-2介导的HO-1表达。

c-Src是Src酪氨酸蛋白激酶家族中高度保守的一种激酶，是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，参与细胞内多种生理功能，如免疫应答、抗原提成以及生长增殖等，并介导 TLR2信号通路从而激活 NF-κB［10，11］。未激活情况下，c-Src 第 527 位酪氨酸处于磷酸化状态而失活。在外源性刺激下，527位酪氨酸残基去磷酸化，随后导致416位酪氨酸自身磷酸化而被激活［12］。本研究证实，MALP-2处理后可显著诱导416位酪氨酸磷酸化，且采用TLR2或TLR6负显性突变体转染后，其磷酸化水平大大降低，表明c-Src是TLR2，6信号通路中发挥重要作用。随后通过RNA干扰后，不但可抑制HO-1的产生，同时也能抑制PI3K的激活。

PI3K是参与细胞生长以及骨架重塑的重要激酶，其激活后可导致脂质底物磷酸化而形成第二信使，并激活下游蛋白激酶B，即Akt。因此检测Akt的磷酸化可间接反映PI3K的激活［13］。有研究显示TLR2和相应配体结合后，可与PI3K形成复合体而参与信号转导［14］。本研究证实MALP-2处理后能明显诱导Akt磷酸化，而RNA干扰c-Src表达后，Akt磷酸化明显降低，这表明c-Src位于PI3K上游。PI3K抑制剂处理THP-1细胞后，HO-1表达明显降低，这表明HO-1受TLR2，6/c-Src/PI3K调控。

总之，本研究证实 MALP-2可通过 TLR2，6/c-Src/PI3K信号通路反馈性诱导HO-1表达，从而维持机体内环境的稳定。但由于MALP-2的主要生物学特性是致炎作用，因此若能从结构上对MALP-2进行改造，降低其致炎活性而保留HO-1的诱导活性，有望为支原体或其他感染性疾病的治疗提供一个新的治疗手段。

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［收稿2013-10-40 修回2013-11-29］

（编辑 许四平）

A m ycoplasma lipopeptide induces hemeoxygenase-1 expression via TLR2，6/c-Src/PI3K pathway in monocytes

YOUXiao-Xing，MAXiao-Hua，LIULiang-Zhuan，ZENGYan-Hua，ZHUCui-Ming，HEJun，JIANGChuan-Hao，WUYi-Mou.InstitutionofPathogenicBiology，MedicalCollege，UniversityofSouthChina，Hengyang421001，China

Objective:To observe themolecularmechanism involved in expression of hemeoxygenase-1（HO-1）induced by a macrophage-activating lipopeptide-2（MALP-2）.Methods:THP-1 cells were cultured in vitro and stimulated by MALP-2 for 12 h，expression of HO-1 was detected by Western blot.TLR2 and TLR6 neutralizing antibodies incubation，dominant negative plasmids transfection were used to assess the functional of TLR2，6 inmediating HO-1 expression.Phosphorylation of c-Src and Aktwere detected by Western blot，and c-Src siRNA and PI3K inhibitor LY294002 were used to investigate the role of c-Src and PI3K in HO-1 expression.Results:MALP-2 induced c-Src phosphorylation，and TLR2 and TLR6 neutralizing antibodies，or their dominant negatively plasmids could abrogate this effect.In addition，siRNA of c-Src could decrease the phosphorylation level of Akt，and the PI3K inhibitor could inhibit HO-1 expression.Conclusion:MALP-2 can induce THP-1 cells expression of HO-1 through TLR2，6/c-Src/PI3K pathways.

Macrophage-activating lipopeptide-2;Hemeoxygenase-1;Monocyte

R392.9

A

1000-484X（2014）05-0587-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.003

①本文为国家自然科学基金（31000091，81072418）、湖南省高校科技创新团队资助项目（湘教通［2010］212号）、湖南省研究生培养创新基金资助项目（湘教通〔2008〕249号）。

②长沙市中心医院，长沙410004。

③南华大学附属南华医院，衡阳421001。

游晓星（1980年－），男，博士，主要从事支原体的感染与免疫机制研究，E-mail:youxiaoxing2013@gmail.com。

及指导教师:吴移谋（1954年－），男，教授，博士生导师，主要从事病原体的致病机制、快速诊断与防治研究，E-mail:yimouwu@sina.com。