hsa-microRNA-218对颗粒溶素表达影响的探讨①

樊 宇 杨 春 张璐渝 杨 静 何永林 徐 蕾 冯 鑫 张春燕 穆柳青（重庆医科大学病原生物学教研室，重庆 400016）

hsa-microRNA-218对颗粒溶素表达影响的探讨①

樊 宇 杨 春 张璐渝②杨 静 何永林 徐 蕾 冯 鑫 张春燕 穆柳青（重庆医科大学病原生物学教研室，重庆 400016）

目的:探讨hsa-microRNA-218（hsa-mir-218）对颗粒溶素（Granulysin，GLS）表达的影响。方法:抽提佛波酯（Phorbol12-myristate 13-acetatefor，PMA）激活的THP-1细胞的总RNA，逆转录后PCR扩增GLS基因，将其克隆至pDsRed-Express-C1，构建GLS表达质粒pDsRed-GLS。将pDsRed-GLS与pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）共转染293T细胞，36 h后激光共聚焦显微镜观察两种质粒在细胞中的表达情况，48 h后提取细胞总RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot检测hsa-mir-218对GLS表达的影响。结果:酶切和测序结果证实重组质粒pDsRed-GLS构建成功，且能与microRNA干扰质粒在293T细胞中共表达。与转染pGenesil-mir-control组细胞相比，Western blot结果显示转染pGenesil-mir-218组细胞GLS蛋白表达下降约50%，而GLSmRNA表达无明显变化。结论:hsa-mir-218在转录后水平干扰了GLS的表达，为进一步探讨mir-218干扰GLS表达的机制打下基础。

颗粒溶素;293T细胞;RNA干扰;激光共聚焦

颗粒溶素（Granulysin，GLS）是由 NK细胞和CTL细胞胞浆颗粒分泌的天然抗菌肽，对结核分枝杆菌（Mycobacteria Tuberculosis，MTB）有较好的杀菌作用。实验室前期研究发现GLS能激发机体特异性Th1型细胞免疫应答，对MTB感染的小鼠有一定的免疫保护和治疗作用［1］。但是临床研究表明结核病人体内GLS的表达明显下降，疾病治愈后GLS 表达回升［2，3］，GLS 表达量与疾病程度负相关的具体机制尚不清楚。考虑到microRNA的负向调控作用［4］，我们在前期实验中成功筛选出与GLS表达相关的 microRNA（hsa-mir-218）［5］，它通过作用于颗粒溶素3’-UTR影响荧光素酶的表达，但hsa-mir-218能否干扰GLS蛋白的表达尚未验证。本实验拟将GLS蛋白表达质粒与microRNA干扰质粒共转染293T细胞，观察hsa-mir-218对GLS蛋白表达的干扰效果，为进一步探讨mir-218干扰GLS表达的机制打下基础。

1 材料与方法

1.1 细胞、质粒及菌株 人肾上皮细胞系293T细胞、人单核白血病 THP-1细胞、pGenesil-mir-218、pGenesil-mir-control、感受态大肠杆菌Top10由重庆医科大学病原生物学教研室保存，pDsRed-Express-C1由上海兽医研究所孟春研究员馈赠。

1.2 主要试剂 DNA marker DL2000、高保真DNA聚合酶、胶回收试剂盒、限制性内切酶BamHⅠ及Kpn I、Total RNA 提取试剂（RNAisoTMPlus）、RTPCR（PrimeScriptTMRT reagent Kit）试剂盒、DEPC均购自TaKaRa公司;T4 DNA连接酶购自Promega公司;质粒小量抽提试剂盒购自OMEGA公司;Taq酶和BCA试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;小鼠抗人GLS多克隆抗体购自abcam公司;小鼠抗人β-actin单克隆抗体、辣根酶标记山羊抗小鼠 IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;Western及IP细胞裂解液、ECL Plus化学发光试剂盒购自碧云天生物技术研究所。胎牛血清、DMEM高糖培养基和0.25%胰酶购自Gibco公司;phorbol-12-myristate-13-acetate（PMA）、Ampicillin Na和Kanamycin均购自Sigma公司。

1.3 pGenesil-mir-218和 pDsRed-GLS的构建 依据miRBase数据库中hsa-mir-218序列，构建携带hsa-mir-218的干扰质粒pGenesil-mir-218，阴性对照命名为 pGenesil-mir-control［5］。

将THP-1细胞置于37℃、5%CO2的恒温培养箱中，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，常规培养传代至对数生长期用于本实验。取1×106个/孔接种于6孔板，添加PMA刺激THP-1细胞，使其终浓度为160 nmol/L。诱导24 h后收集细胞并按试剂盒说明提取总RNA，逆转录后PCR扩增GLS基因。依据GenBank中登录的GLS基因序列（NC_006433.3）用 PRIMER软件进行引物设计:P1:5'-GGGGTACCGTATCTGTGGTAAACCCAGT-3'（下划线为KpnⅠ酶切位点），P2:5'-CGGGATCCTCTTGCTTGACACTTTATTC-3'（下划线为BamHⅠ酶切位点）。扩增条件:95℃预变性3 min;98℃变性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸 1 min，循环 30次;72℃ 延伸 6 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

胶回收 PCR产物，与质粒 pDsRed-Express-C1分别经 KpnⅠ和 BamHⅠ双酶切，纯化后，用 T4 DNA连接酶4℃连接过夜。将连接产物转化至感受态大肠杆菌Top10，挑选阳性单菌落，提取质粒，进行PCR及酶切鉴定。鉴定正确后的质粒命名pD-sRed-GLS，并送上海英潍捷基公司测序。

1.4 细胞培养及瞬时转染 293T细胞用含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100μg/m l链霉素的DMEM高糖完全培养基，于37℃、5%CO2的恒温培养箱中培养。转染前一天，取对数生长期的细胞，按2.5×105个/孔接种于激光共聚焦专用培养皿，待细胞汇合度达80% ～90%时，行共转染。操作按LipofectamineTM2000试剂说明书进行。pDsRed-GLS与pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）的质量比为1/5。

1.5 激光共聚焦 pDsRed-GLS与 pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）共转染36 h后，激光共聚焦显微镜下观察两质粒在同一细胞中的表达情况，并拍照。

1.6 RT-PCR法检测GLSmRNA的表达 转染后48 h，用预冷的PBS轻柔洗涤293T细胞，每1×107个细胞添加1 ml RNAisoTMPlus试剂，水平放置使裂解液均匀分布于细胞表面。收集裂解后的两组细胞溶液按操作说明提取总RNA并定量。取2μg总RNA逆转录合成cDNA链，以cDNA为模板PCR扩增GLS片段。根据GenBank中登录的GLS基因序列（NM_006433.3）和内参人β-actin基因序列（NM_002046）设计引物，序列如下:GLS p1:5'-GTATCTGTGGTAAACCC-3'，GLS p2:5'-GCTTGACACTTTATTCTCG-3';β-actin p1:5'-GGGAAATCGTGCGTGACA-3'，β-actin p2:5'-TCAGGAGGAGCAATGATC-3'。反应条件为:95℃预变性3 min;95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共30个循环;72℃再延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收试剂盒回收后，送上海英潍捷基公司测序。

1.7 Western blot检测细胞中GLS蛋白的表达 按操作说明用预冷的PBS洗涤293T细胞一次，添加蛋白质抽提试剂（1 mlWestern及IP细胞裂解液+10μl PMSF），冰浴摇动5 min使其分布均匀。收集细胞，转移细胞液到离心管中，冰浴摇动15 min进行裂解，14 000×g离心15 min后，取上清蛋白质溶液。95℃ 5 min使蛋白变性，BCA法测定蛋白浓度，每上样槽等量上样（50μg），蛋白样品经16%SDSPAGE凝胶电泳后105 V 105 min电转印至PVDF膜，封闭液封闭 1 h，用小鼠抗人 GLS抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜。次日，PBST洗涤5 min×3次，加入HRP标记山羊抗小鼠IgG（1∶5 000），室温孵育2 h。均匀滴加ECL Plus化学发光检测试剂于PVDF膜上，Bio-Rad凝胶成像系统曝光采集图像。

1.8 统计学处理 数据以x－±s表示，SPSS17.0统计软件包行t检验，检验水准以P＜0.05为有统计学差异。

2 结果

2.1 重组质粒pDsRed-GLS的鉴定 1%琼脂糖凝胶电泳分析显示，PCR扩增得到了长度为751 bp的GLS基因序列（图1）。重组质粒经Kpn I/BamH I双酶切后产生大小为751 bp的片段与预期大小相符（图1）;测序结果表明目的基因片段与GenBank公布的序列一致（图2）。

2.2 pDsRed-GLS 与 pGenesil-mir-218（pGenesilmir-control）在细胞内的共表达 激光共聚焦显微镜观察结果表明:pDsRed-GLS与 pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）共转染293T细胞36 h后，pDsRed-GLS表达的红色荧光蛋白与pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）表达的绿色荧光蛋白分布于整个细胞（图3）。

图1 重组质粒pDsRed-GLS的鉴定Fig.1 Identification of recombinant plasm id pDsRed-GLS

图2 pDsRed-GLS测序鉴定结果（部分）Fig.2 Partial result of DNA sequencing of pDsRed-GLS

2.3 RT-PCR检测GLSmRNA表达变化 RT-PCR结果显示:与转染pGenesil-mir-control组相比，转染pGenesil-mir-218组GLSmRNA的表达无明显变化（P＞0.05）（图4）。

2.4 Western blot检测GLS蛋白表达变化 Western blot结果显示，与转染pGenesil-mir-control组相比，转染pGenesil-mir-218组GLS蛋白表达明显减少（P＜0.05），密度扫描半定量分析显示GLS表达下降约50%，说明hsa-mir-218在转录后水平对GLS表达进行了干扰（图5）。

图3 激光共聚焦显微镜观察pDsRed-GLS与pGenesilm ir-218（pGenesil-m ir-control）共转染293T细胞（×200）Fig.3 Photom icrographs of 293T cells captured 36 h after co-transfection using a laser con focal m icroscope（×200）

图4 RT-PCR检测GLSm RNA表达变化Fig.4 RT-PCR analysis of expression of GLSmRNA

图5 W estern blot检测GLS蛋白表达变化Fig.5 Western blot analysis of expression of GLS protein

3 讨论

GLS是存在于NK细胞和CTL细胞胞浆颗粒中的抗菌肽，它通过破坏细胞膜的稳定性可直接杀灭结核分枝杆菌（Mycobacteria Tuberculosis，MTB）［6］，而且实验室前期研究发现GLS通过激发机体特异性Th1型细胞免疫应答，对MTB感染的小鼠能产生一定的免疫保护和治疗作用［1］。同时临床研究显示结核病患者体内GLS的表达明显下降，疾病治愈后GLS表达回升［2，3］，提示 GLS表达量与结核病病情程度负相关。为阐明其负相关的机制，我们在前期实验中证实hsa-mir-218可使携带GLS 3’-UTR的荧光素酶报告质粒表达的荧光素酶降低75%左右，表明hsa-mir-218可能对GLS的表达有干扰作用［5］。本实验中，我们构建GLS表达质粒，并与hsa-mir-218干扰质粒共转染293T细胞，在蛋白水平进一步验证hsa-mir-218对GLS的干扰效应。

许多真核表达载体如本实验所用pDsRed-Express-C1和pGenesil-1中含有SV40病毒的复制起始位点和启动子，可以在表达SV40病毒大T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。人胚肾细胞293T就是一种表达SV40病毒大T抗原的细胞系，它来源于293细胞，经改造后在其中插入了SV40病毒大T抗原，因此用293T细胞做转染可以获得较高的表达水平。且GLS是表达于CTL细胞和NK细胞胞浆颗粒中，在293T细胞不表达，于是我们构建GLS表达质粒并转染入293T细胞，使外源GLS在293T细胞内高效表达，从蛋白水平验证hsa-mir-218对外源性GLS表达的干扰效应。

为明确GLS与hsa-mir-218在细胞中的共表达情况，分别将GLS编码框和hsa-mir-218序列插入表达不同荧光蛋白的pDsRed-Express-C1和pGenesil-1中，激光共聚焦显微镜下观察两者的共表达情况。pDsRed-Express-C1表达的DsRed是珊瑚虫红色荧光蛋白的突变体，是在珊瑚虫红色荧光蛋白基础上发生了9个氨基酸置换，使蛋白质溶解度增加，并缩短从转染到红色荧光蛋白表达检测的时间，具有寡聚化程度低、成熟速率快等优点［7］。干扰载体pGenesil-1表达的增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）具有发光效率高、抗光漂白能力强等优点，且波长与红色荧光激发及发射波长不重叠［8］，所以在激光共聚焦下可以清晰的分别观察两种荧光，以确定GLS与hsa-mir-218在细胞内的共表达情况。

本实验通过构建GLS表达载体，与干扰质粒共转染293T细胞，36 h后激光共聚焦显微镜确认其在细胞中共表达，48 h后分别提取总RNA和蛋白质，结果显示GLSmRNA表达量未发生明显改变，而GLS蛋白表达下降50%，说明hsa-mir-218在转录水平对GLS的表达无明显影响，而对其在转录后水平的表达有明显干扰作用。本研究结果提示结核病患者体内GLS表达量的变化可能与体内某些miRNA的调节有关，而且miRNA对GLS的调节作用发生在转录后水平，这为进一步探讨mir-218干扰GLS表达的机制打下基础，同时为利用miRNA防治结核病提供了新的思路。

［1］ Yang C，He YL，Zhang L，et al.GLS/IL-12-modified Mycobacterium smegmatis as a novel anti-tuberculosis immunotherapeutic vaccine［J］.Int JTuberc Lung Dis，2009，13（11）:1360-1366.

［2］ Andersson J，Samarina A，Fink J，et al.Impaired expression of perforin and granulysin in CD8+T cells at the site of infection in human chronic pulmonary tuberculosis［J］.Infect Immun，2007，75（11）:5210-5222.

［3］ Di Liberto D，Buccheri S，Caccamo N，et al.Decreased serum granulysin levels in childhood tuberculosiswhich reverse after therapy［J］.Tuberculosis（Edinb），2007，87（4）:322-328.

［4］ Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function［J］.Cell，2004，116（2）:281-297.

［5］ 杨 静，杨 春，何永林，等.GLS 3’-非编码区-荧光素酶报告质粒的构建及其活性鉴定［J］.免疫学杂志，2013，29（1）:33-37.

［6］ Krensky AM，Clayberger C.Biology and clinical relevance of granulysin［J］.Tissue Antigens，2009，73（3）:193-198.

［7］ 郝丽梅，李唐棣，梅兴国.红色荧光蛋白的研究进展［J］.国外医学·药学分册，2006，33（2）:131-133.

［8］ Paul BK，Guchhait N.Looking at the Green Fluorescent Protein（GFP）chromophore from a different perspective:a computational insight［J］.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2013，103:295-303.

［收稿2013-11-19 修回2013-12-02］

（编辑 许四平）

Effect of hsa-m icroRNA-218 on granulysin expression

FANYu，YANGChun，ZHANGLu-Yu，YANGJing，HEYong-Lin，XULei，FENGXin，ZHANGChun-Yan，MULiu-Qing.DepartmentofMicrobiology，ChongqingMedicalUniversity，Chongqing400016，China

Objective:To elucidate the effect of hsa-microRNA-218（hsa-mir-218）on exogenous granulysin（GLS）expression in 293T cells.Methods:Total RNA was extracted from THP-1 cells induced by phorbol12-myristate 13-acetatefor（PMA），and GLS gene was amplified by RT-PCR，and then cloned into pDsRed-Express-C1 to construct the GLS expression vector pDsRed-GLS.Then 293T cells were co-transfected with pDsRed-GLSand pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）and laser confocalmicroscopy was performed 36 h later to detect their co-expression.Total RNA and protein were extracted 48 h post transfection，and RT-PCR and Western blot were performed to detect the effectofhsa-mir-218 on exogenous GLSexpression.Results:The GLSexpression vector pDsRed-GLS was constructed successfully and laser confocalmicroscopy indicated that it was co-expressed with the interference vector.Compared with thatof cells transfected with pGenesil-mir-control，Western blot showed amarkedly decrease of GLSprotein expression（50%）in the cells transfected with pGenesil-mir-218.However，GLSmRNA expression remained unchanged.Conclusion:hsa-mir-218 negatively regulates GLS expression at a post-transcriptional level，and this provides an experimental basis for future study ofmechanism of GLS expression regulated bymir-218.

Granulysin;293T cells;RNA interference;Laser confocalmicroscopy

R378.91+1

A

1000-484X（2014）05-0596-04

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.005

①本文为国家自然科学基金项目（No.30901280）。

②通讯作者，E-mail:zly1962@yahoo.com.cn，重庆医科大学分子医学与肿瘤研究中心，重庆 400016。

樊 宇（1988年－），男，主要从事结核分枝杆菌感染与免疫研究。

及指导教师:杨 春（1964年－），女，博士，教授，教研室主任，硕士生导师，主要从事细菌感染与免疫研究，E-mail:yangchunim@163.com。