富硒酵母对长期缺硒和正常大鼠体内D-丝氨酸和L-丝氨酸水平的影响

余海立 张 彦* 张凤伟 张海波 程 倩 陈智仙 董运海 李婉奕 张双庆

(1.安琪酵母股份有限公司，酵母功能湖北省重点实验室，宜昌443003；2.中国疾病预防控制 中心营养与健康所，北京100050)

硒是人和动物必需的微量元素，机体摄入硒不足时，脑是最后出现缺硒的器官，硒对维持神经系统生理功能发挥重要作用[1]。Babür等[2]研究发现，给予21 d缺硒饲粮导致大鼠空间学习能力降低。Sharma等[3]研究发现，缺硒引起小鼠大脑皮质中铁含量升高和认知功能下降。人群调查表明体内硒水平随着年龄的增加显著降低，硒水平与认知功能存在正相关，缺硒会引起认知功能下降，进而引起阿尔兹海默症、帕金森症等神经疾病的发生[4]。

L-丝氨酸是人体非必需氨基酸，参与核酸和蛋白质代谢，可促进脂肪酸代谢、肌肉生长与神经细胞鞘合成，在调节机体健康中发挥重要生物学功能[5]。L-丝氨酸经丝氨酸消旋酶转化合成D-丝氨酸，D-丝氨酸是动物体内水平较高的D型氨基酸之一，广泛存在于血液、视网膜、脑部组织中，作为神经递质在中枢神经系统中发挥重要作用[6]。D-丝氨酸是机体必需的功能性氨基酸，在氧化应激、免疫、神经性疾病等过程中发挥重要的生物学功能。研究发现阿尔兹海默症模型小鼠脑中D-丝氨酸水平显著升高，阿尔兹海默症患者脑脊液中D-丝氨酸水平显著升高，D-丝氨酸被认为是阿尔兹海默症的一种新型生物标志物[7]。Mickiewicz等[8]研究发现，给予C57BL/6小鼠32周的低硒饲粮会引起血清中丝氨酸水平显著升高。Yim等[9]研究表明，给予C57BL/6J小鼠5周缺硒饲粮会引起肝脏中丝氨酸水平显著下降，对大脑中丝氨酸水平无显著影响。上述研究结果表明缺硒可引起丝氨酸代谢水平的变化，但未明确是D-丝氨酸还是L-丝氨酸。

临床研究发现补硒对阿尔兹海默症、帕金森症、小脑萎缩症等神经退行性疾病具有良好的预防和治疗作用[10]。硒可以降低脂质过氧化反应，减少淀粉样蛋白的聚集，降低Tau蛋白的过度磷酸化并抑制神经纤维缠结的形成，改善小鼠的认知功能障碍[11]。目前，长期缺硒对大脑D-丝氨酸、L-丝氨酸水平的影响，以及体内缺硒和足硒时补硒对机体尤其是脑部D-丝氨酸、L-丝氨酸水平影响的研究还未见报道。本试验在前期研究[12]的基础上，建立长期缺硒大鼠模型，旨在研究以富硒酵母形式补充不同剂量硒112 d对缺硒和正常大鼠血浆、大脑皮质、海马中D-丝氨酸、L-丝氨酸水平的影响，明确体内硒水平与D-丝氨酸、L-丝氨酸水平的关系，为确证D-丝氨酸是否为硒改善认知功能损伤的生物标志物提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验用Sprague-Dawley大鼠购自三峡大学实验动物中心，生产许可证号为SCXK(鄂)2017-0012。选取3周龄Sprague-Dawley大鼠120只，随机分为缺硒组(n=75)和对照组(n=45)。缺硒组饲喂低硒饲粮(含0.02 mg/kg硒)，正常组饲喂正常饲粮(含0.18 mg/kg硒)，饲喂期为420 d。第1～60天使用AIN-93G型饲粮，试验第61～420天使用AIN-93M型饲粮，饲养期间缺硒组死亡6只，正常组死亡5只。试验第421天，将缺硒组大鼠分成4组：缺硒空白对照组(SD-B组，n=17)、缺硒富硒酵母低剂量组(SD-LY组，n=16)、缺硒富硒酵母中剂量组(SD-MY组，n=20)、缺硒富硒酵母高剂量组(SD-HY组，n=16)。将正常组大鼠分为2组：正常空白对照组(SS-B组，n=20)、正常富硒酵母中剂量组(SS-MY组，n=20)。SD-B组继续饲喂低硒饲粮，SD-LY、SD-MY、SD-HY组分别饲喂含0.18、0.36和0.72 mg/kg硒的富硒酵母饲粮，SS-B组继续饲喂正常饲粮，SS-MY组饲喂含0.36 mg/kg硒的富硒酵母饲粮，饲喂期为112 d。大鼠低硒饲粮按照AIN-93标准配制，其组成及营养水平见表1。正常饲粮和富硒酵母饲粮是在低硒饲粮的基础上分别添加亚硒酸钠和富硒酵母，具体试验设计见表2。大鼠实行分笼饲养，控制环境温度在(20±2) ℃，相对湿度在55%～65%，自由饮食。

表1 低硒饲粮组成及营养水平(风干基础)

表2 试验设计

1.2 试验材料与仪器

主要材料：富硒酵母，硒含量为2 104 mg/kg。

主要仪器：iCAP RQ电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，美国赛默飞世尔科技公司)、Agilent 1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦安捷伦科技有限公司)。

1.3 检测指标及方法

1.3.1 样品采集

试验第532天后，将大鼠用乙醚麻醉，眼静脉丛取血，肝素钠抗凝，1 520×g离心10 min，取血浆，-80 ℃保存，用于血浆硒水平的测定；断头后迅速在冰盘上分离皮质、海马、小脑，-80 ℃保存，用于硒以及D-丝氨酸和L-丝氨酸水平的测定；分离心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸等器官，滤纸吸干后称量并记录，并计算器官指数。

1.3.2 生长性能与器官指数测定

试验开始和结束时以及每隔30 d测定各组大鼠体重。器官指数计算公式如下：

器官指数(%)=(器官重量/体重)×100。

1.3.3 硒水平测定

用0.5%硝酸将100 μL血浆稀释至2.0 mL，混匀离心后取上清过滤，得到待测液，参照余海立等[12]的方法测定硒水平。脑组织经微波消解，定容至50 mL，即为待测液，使用电感耦合等离子体质谱仪测定硒水平。饲粮硒水平参照GB/T 13883—2008《饲料中硒的测定》中的氢化物原子荧光光谱法测定。

1.3.4D-丝氨酸和L-丝氨酸水平测定

血浆样品经甲醇沉淀蛋白，取上清，氮气吹干，衍生化后得到待测液，参照余海立等[12]方法测定D-丝氨酸、L-丝氨酸水平。称取一定量的海马、大脑皮质，加入甲醇低温下研磨，离心后取上清，氮气吹干，衍生化后得到待测液，采用高效液相色谱法测定D-丝氨酸和L-丝氨酸水平。

1.4 数据统计与分析

试验数据采用SPSS 23.0软件进行分析，缺硒组和正常组之间差异显著性采用t检验分析。补硒试验中的各组数据采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，试验数据以平均值±标准差表示，P<0.05和P<0.01分别为差异显著和极显著水平。

2 结果与分析

2.1 体重

由图1可知，低硒饲粮饲喂60 d后，缺硒组大鼠体重显著低于正常组大鼠(P<0.05)。补硒112 d后，各组大鼠体重无显著差异(P>0.05)。结果表明，缺硒会使大鼠生长发育缓慢，体重降低；补硒可使缺硒大鼠体重恢复正常。

2.2 器官指数

由表3可知，各组间心脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸指数差异不显著(P>0.05)。与SD-B组相比，SD-LY组肝脏指数显著降低(P<0.05)，SS-MY组肝脏指数极显著降低(P<0.01)。

“*”表示与缺硒组相比差异显著(P<0.05)，“**”表示与缺硒组相比差异极显著(P<0.05)。

表3 饲粮硒水平对大鼠器官指数的影响

2.3 硒水平

2.3.1 血浆硒水平

由图2可知，与SS-B组相比，SD-B组大鼠血浆硒水平显著降低(P<0.05)。与SD-B组相比，SD-LY、SD-MY和SD-HY组血浆硒水平显著升高(P<0.05)，与SS-B组相比，SS-MY组血浆硒水平无显著变化(P>0.05)，说明通过在饲粮中添加富硒酵母补硒，可使缺硒大鼠血浆硒水平恢复到正常水平。

图2 饲粮硒水平对大鼠血浆硒水平的影响

2.3.2 大脑皮质和小脑硒水平

由图3可知，SD-B和SS-B组大鼠大脑皮质和小脑硒水平无显著差异(P>0.05)，说明饲喂低硒饲粮对大鼠大脑皮质和小脑硒水平无显著影响(P>0.05)。与SD-B组相比，SD-LY、SD-MY、SD-HY和SS-MY组大脑皮质硒水平极显著升高(P<0.01)，SD-LY组小脑硒水平略有升高(P>0.05)，SD-MY、SD-HY和SS-MY组小脑硒水平显著或极显著升高(P<0.05或P<0.01)，说明通过在饲粮中添加富硒酵母补硒，可显著提高大鼠大脑皮质和小脑中硒水平，且呈剂量依赖。

图3 饲粮硒水平对大鼠大脑皮质和小脑硒水平的影响

2.4 D-丝氨酸和L-丝氨酸水平

2.4.1 血浆D-丝氨酸和L-丝氨酸水平

由图4可知，与SD-B组相比，SD-LY、SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY组血浆L-丝氨酸水平显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01)，血浆D-丝氨酸水平无显著变化(P>0.05)，说明长期缺硒使大鼠血浆L-丝氨酸水平显著升高，补硒可以使其恢复到正常水平。

图4 饲粮硒水平对大鼠血浆D-丝氨酸和

2.4.2 大脑皮质D-丝氨酸和L-丝氨酸水平

由图5可知，与SD-B组相比，SD-LY组大脑皮质L-丝氨酸水平显著降低(P<0.05)，SD-MY、SD-HY、SS-B和SS-MY组大脑皮质L-丝氨酸水平也有所降低，但差异不显著(P>0.05)。与SD-B组相比，SD-LY和SD-MY组大脑皮质D-丝氨酸水平降低，SD-HY、SS-B和SS-MY组大脑皮质D-丝氨酸水平升高，但差异均不显著(P>0.05)。

图5 饲粮硒水平对大鼠大脑皮质D-丝

2.4.3 海马D-丝氨酸和L-丝氨酸水平

由图6可知，与SD-B组相比，SD-HY组海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平极显著升高(P<0.01)，SD-MY组海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平也有所升高，但差异不显著(P>0.05)，SD-LY、SS-B和SS-MY组海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平无显著变化(P>0.05)，说明饲粮中添加高剂量富硒酵母可以显著升高大鼠海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平。

图6 饲粮硒水平对大鼠海马D-丝氨酸和

3 讨 论

3.1 富硒酵母对大鼠体内硒水平和生长发育的影响

血浆硒水平是反映体内硒营养状态的指标。田俊梅等[13]认为血清硒水平降低为270 ng/mL，大鼠处于低硒状态。本试验发现，饲喂缺硒饲粮420 d后，大鼠血浆硒水平为159 ng/mL，说明缺硒大鼠造模成功。Sharma等[3]研究发现，给予BALB/c小鼠低硒、足硒、过量硒饲粮24周，低硒组小鼠大脑皮质硒水平显著下降，小脑硒水平未见显著变化；过量硒组小鼠大脑皮质和小脑硒水平未见显著变化。Akahoshi等[14]研究发现，给予C57BL/6J小鼠为期6周的低硒饲粮(含硒0.026 mg/kg)，1周后小鼠心脏、肝脏、肾脏等脏器硒水平显著下降，4周后大脑硒水平显著下降。本研究发现，给予大鼠缺硒饲粮532 d，缺硒大鼠大脑皮质和小脑硒水平未出现显著变化，这与上述缺硒小鼠的研究结果不一致，可能与种属不一致有关，有待进一步研究。硒通过硒蛋白发挥重要生理功能，硒蛋白脱碘酶调节三碘甲腺原氨酸(T3)、四碘甲腺原氨酸(T4)水平，T3、T4调节甲状腺激素的分泌，因此长期缺硒可能通过影响脱碘酶活性引起动物生长发育缓慢[15]，本研究发现缺硒60 d后缺硒组大鼠体重增长显著放缓，Amer等[16]发现通过补硒可以得到改善。

3.2 富硒酵母对大鼠体内D-丝氨酸和L-丝氨酸水平的影响

L-丝氨酸是机体所需的一种氨基酸，在不同阶段发挥不同的生理功能，主要参与蛋白质、脂质、核苷酸、神经递质等的合成，同时也是一种重要的神经营养因子，可转化为D-丝氨酸和甘氨酸，两者均为重要的神经递质，参与突触传递、突触可塑性和兴奋性毒性的调节，并且D-丝氨酸还在大脑发育、学习和记忆等生理过程中发挥重要作用[17]。现有研究表明长期缺硒使小鼠血清丝氨酸水平增加[8]，肝脏丝氨酸水平降低，对大脑丝氨酸水平无显著影响[9]，但未明确是D-丝氨酸还是L-丝氨酸。本课题组前期研究发现，长期缺硒对大鼠血浆、小脑D-丝氨酸、L-丝氨酸水平无显著影响[13]。本研究发现，长期缺硒大鼠血浆L-丝氨酸水平显著升高，大脑皮质L-丝氨酸水平升高，海马L-丝氨酸水平无显著变化，血浆、大脑皮质和海马D-丝氨酸水平无显著变化。与前期研究[13]相比，本研究延长了缺硒时间，发现大鼠血浆L-丝氨酸水平显著升高，可能是长期饲喂缺硒饲粮引起体内硒水平下降，影响硒蛋白的合成，L-丝氨酸为硒蛋白合成提供碳骨架，硒蛋白合成降低可能引起血浆L-丝氨酸水平的升高。此外，L-丝氨酸具有抗氧化活性，L-丝氨酸水平的增加可能是机体应对硒水平下降引起的氧化应激的增加。进行补硒后发现，与SD-B组相比，SD-LY、SD-MY和SD-HY组血浆L-丝氨酸水平显著降低。这可能是由于补硒显著提高血浆硒水平，使硒蛋白合成增加，消耗大量L-丝氨酸，造成血浆L-丝氨酸水平下降。大鼠长期缺硒后海马L-丝氨酸水平未出现显著变化，补充高剂量硒后海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平显著升高，这可能是由于L-丝氨酸不能通过血脑屏障，大脑利用葡萄糖从头合成大量L-丝氨酸以满足硒蛋白合成的生理需要[18]，引起海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平升高。与SS-B组相比，缺硒532 d大鼠皮质L-丝氨酸水平升高，但无显著差异，补充低剂量硒后L-丝氨酸水平显著降低，恢复至SS-B组水平。缺硒大鼠大脑皮质L-丝氨酸水平增加可能是机体应对缺硒引起的氧化应激水平增加，补硒使大脑皮质硒水平升高，进而使得L-丝氨酸水平恢复正常。

4 结 论

① 补硒使缺硒大鼠体重恢复正常，并可显著提高大鼠血浆、大脑皮质、小脑硒水平。

② 长期缺硒使大鼠血浆L-丝氨酸水平显著升高，但对大脑皮质、海马L-丝氨酸水平无显著影响，血浆、大脑皮质、海马D-丝氨酸水平也无显著影响。

③ 以富硒酵母形式补硒，饲粮硒水平为0.18、0.36和0.72 mg/kg时可显著降低缺硒大鼠血浆L-丝氨酸水平，饲粮硒水平为0.72 mg Se/kg时还可显著升高缺硒大鼠海马L-丝氨酸和D-丝氨酸水平。