基质金属蛋白酶-2、-9与脑缺血微血管损伤的关系

刘昱言 刘 轲 刘敬霞 李建生

(河南中医学院第一附属医院，河南 郑州 450000)

缺血性脑血管疾病(ICVD)约占全部脑血管意外的60%～80%〔1〕。大多数的ICVD是由动脉血管内血栓阻塞血管所致，理想的治疗方法是早期再通闭塞的血管。溶栓治疗可在有效的时间窗内溶解血栓，恢复血流，挽救缺血半暗带的部分损伤脑组织，是急性脑梗死治疗中挽救缺血脑组织的最佳方案〔2〕。但溶栓后血流再通及再灌注损伤可引起脑微血管基底膜模糊、断裂、水肿,出现节段性溶解、脱落、缺损,微血管结构完整性受损,这不仅加重缺血区域神经细胞损伤；而且使血脑屏障(BBB)通透性增高,引起毛细血管内水分和血浆蛋白外渗,导致血管源性脑水肿。近年来研究发现，基质金属蛋白酶(MMP)-2、-9在脑微血管损伤的病理过程中发挥重要作用，此为脑缺血微血管损伤的病理生理机制及其治疗提供新思路。MMP-2、-9属于蛋白酶家族中的明胶酶系，通常降解细胞-1(TIMP-1)可特异性地对抗其增强，起到保护微血管受损的作用。现就MMP-2、-9与脑缺血微血管损伤的关系进行综述。

1 明胶酶系

1.1分类 明胶酶系属于MMPs家族中的成员，所谓MMPs是一组具有许多共同生化性质的可降解细胞外基质(ECM)的钙离子和锌离子依赖性内肽酶，以酶原形式存在,在细胞外激活,激活的MMPs可选择性降解多种ECM成分,主要包括：胶原、明胶、纤维连接蛋白、弹性蛋白和蛋白多糖等。依据其作用底物的不同可分为胶原酶(MMP-1,-8等)、明胶酶(MMP-2,-9)、间质溶解素(MMP-3,-10，-11)、膜型MMPs(MMP-14,-15,-16,-17)和其他成员(基质降解素、巨噬细胞弹性蛋白酶)。其中，MMP-2、-9因在催化区内含有3个重复的纤维连接蛋白-Ⅱ基因片段,共用具有相似的蛋白水解活性和降解变性的胶原、明胶、还有一些细胞外基质分子被称为“明胶酶系”。这些细胞外基质分子包括天然Ⅳ，Ⅴ和Ⅺ型胶原、层黏连蛋白及聚集蛋白聚糖核心蛋白。MMP-2因相对分子质量为 72×103(72 kD)又被称为72 kD Ⅳ型胶原酶或明胶酶A，主要底物包括明胶、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原、层黏连蛋白、弹性蛋白及纤维连接蛋白。MMP-9的相对分子质量为92×103(92 kD)被称为92 kD Ⅳ型胶原酶或明胶酶B，主要底物包括明胶、Ⅳ、Ⅴ型胶原和弹性蛋白。MMP-2还能溶解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原。然而，MMP-2的胶原酶活性相对其他酶弱一些。由于MMP-2酶原被募集于细胞表面并由膜结合的MT-MMPs激活，它可聚集于细胞外并表达某种原生胶原酶活性，并能发挥协同作用，使胶原分解为更小的碎片，这些碎片会在37℃的体温下变性〔3〕。

1.2MMP-2 、MMP-9在中枢神经系的分布、表达及作用 健康人类的中枢神经系统,可检测到星形胶质细胞、神经细胞、小胶质细胞、毛细血管内皮细胞及中性粒细胞等都能释放MMP-2、-9。MMP-2 mRNA、蛋白质、酶活性广泛存在于脑组织中,胶质细胞中最多。活性MMP-2产生于星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞和神经细胞。MMP-9 mRNA、蛋白质、酶活性主要存在于海马、小脑和大脑皮层的神经细胞中,MMP-9的蛋白和酶活性主要在胞体和树突中，而且体外研究表明MMP-9蛋白可在体外培养的海马神经元表达〔4〕。

MMPs在健康中枢神经系统中是调控生长发育的一种重要蛋白酶，能选择性作用多种ECM成分，消化降解间质内的ECM成分，并影响基质的重塑，通过维持ECM成分合成和降解的动态平衡。当神经系统出现损伤时起修复神经系统的作用，但某些情况下，机内的一些MMPs同时急剧升高反而会导致机体病理损伤。因此，MMPs有双重功能，一方面能介导神经修复和功能恢复，另一方面又造成机体损。在正常稳定状态的组织中，MMPs表达量极少；而在涉及人体多种生理和病理过程中，如炎症，新生血管形成，肿瘤侵袭转移时，其表达量上升。

1.3MMP-2 、MMP-9的活性调节 MMPs的生物活性受基因转录、酶原活化和酶抑制剂等多因素调控，其中转录水平包括白介素(IL)-1、IL-12、血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子α(TGF)-α、肿瘤坏死因子(TNF)-α等。研究表明TNF-α能上调MMPs的表达；TGF-β、IFN-γ、类固醇激素(包括糖皮质激素)和视黄醛则下调MMPs的表达〔5〕。MMPs是以无活性的酶原形式分泌的，通常认为只有被活化后才能降解基质蛋白，这是控制ECM降解的重要调节机制。研究表明:纤溶酶原在尿激酶纤溶酶原活化剂或组织纤溶酶原活化剂(uPA或tPA)催化下变成纤溶酶，纤溶酶可部分激活间质胶原酶和基质分解素原〔6〕。MMP-2体内激活途径与其他MMPs不同，不被plasmin/uPA系统激活，而是通过其C末端与位于细胞膜表面的MT1-MMP相互作用而激活。金属蛋白酶相互间也存在着激活作用，研究表明，受损血管平滑肌细胞中MMP-3增加，而MMP-3可诱导MMP-2，MMP-9的表达，共同参与血管壁损伤〔7〕。MMPs分子之间存在的相互级联激活机制对于调节MMPs的潜在活性具有重要作用，同时也把MMPs与纤溶系统联系在一起。TIMP调控，MMPs的蛋白水解酶活性受非特异性和特异性抑制剂的抑制，非特异性抑制剂包括a2-巨球蛋白、a1-抗蛋白酶和BB-94(batimistat)；特异性抑制剂为组织型TIMPs。目前发现的，TIMPs分4型，它以1∶1的比例与活化的MMPs结合，并抑制其活性。TIMP-1抑制大多数MMPs的活性，但不包括MT1-MMP和MMP-2；TIMP-2对除MMP-9外的大多数MMPs均有抑制作用；TIMP-3具有抑制MMP-1,-2,-3,-9,-13活性的作用。TIMP-4则参与稳定ECM。TIMPs在ECM代谢中起着与MMPs对应的负性调节作用，可阻止MMPs的活化，并抑制其作用，影响蛋白分解损伤的程度和持续时间。在一些基质过度降解的疾病，MMPs和TIMPs之间平衡失调，导致MMPs活性总体上净增加〔3〕。

2 MMP-2、MMP-9与BBB损伤

脑部微血管与体内大多数微血管床不同，小分子的溶质不能自由通过脑微血管，即所谓BBB。其主要结构包括内皮细胞(EC)、EC的紧密连接(TJ)、星形细胞、周皮细胞和血管周围的小胶质细胞以及基底膜等。当脑组织发生病变时,脑微血管是受侵害的首要靶点,缺血可以使脑微血管结构发生损伤性变化。微血管结构的损害导致BBB功能破坏,加重缺血区域神经细胞损伤。许多著名的实验研究均证明永久或短暂性脑缺血后病变区MMP-2与MMP-9表达增加，同时有ECM中的片蛋白、纤维连接蛋白与Ⅳ型胶原的消失、毛细血管通透性增加，注射Evans蓝可见外溢。脑缺血后缺血区MMP-2与MMP-9表达有明显的时间差异，MMP-9表达时间比MMP-2早。缺血后3～4 h缺血区MMP-9表达开始增加,12 h明显增高,4～5 d达到高峰，一直持续到缺血后第15天表达恢复至基础水平。MMP-2则从缺血后24 h出现低水平表达，第5天开始表达增高,至30 d时仍有不明显的低水平表达。MMP-2与MMP-9这种表达时间上的差异可能是由于MMP-9与急性期BBB损伤有关,而MMP-2则与缺血后损伤的修复有关〔8〕。缺血后MMP-2和MMP-9对BBB损伤主要表现在为降解内皮细胞和基底膜的底物。研究表明：内皮细胞同体内其他细胞一样，在生长分化过程中，也产生丰富的ECM，其中Ⅳ型胶原是内皮细胞产生的特异性ECM。这些基质成分部分存在于内皮细胞间隙，部分在内皮细胞下形成内皮细胞基底膜。内皮ECM除了维持内皮细胞正常生存、分化和运动外环境，还与内皮的屏障功能有关。MMP-2和MMP-9能特异性地分解Ⅳ型胶原，对内皮细胞通透性具有直接的调控作用。血管内皮生长因子(VEGF)显著促进内皮细胞产生MMP-2，MMP-2抗体显著抑制VEGF增加内皮细胞单层通透性作用，结果表明MMP-2活性改变以及由此导致的特异性基质的分解可能与VEGF的促通透作用有关。实验中未观察到MMP-9的产生，表明MMP-2是内皮细胞中惟一介导VEGF促通透作用的Ⅳ型胶原酶〔9〕。俞鸣〔10〕通过临床观察表明，急性脑梗死患者血清VEGF和MMP-9水平均明显升高， 血清VEGF和MMP-9水平与脑梗死患者的梗死面积有一定相关性。ECM由细胞间的多种蛋白质和非蛋白质组成，构成细胞生活的微环境，具有支持、连接、营养和防御等生理作用。ECM和基底膜的降解，在一定程度上决定着血管的完整性〔11〕。脑毛细血管壁基底膜的主要成分为Ⅳ型胶原、层黏蛋白和纤维连接蛋白，局灶性脑缺血可以引起基底膜通透性和结构的变化，造成BBB损伤。Heo等〔12〕研究表明将Wisrar大鼠大脑中动脉(MCA)阻断30 min就可出现MMP-9水平的升高，这一时间窗内同时出现水和离子从紧密连接处流出，说明MMP-9在缺血刚开始时就出现上调，在BBB降解过程发挥作用。

3 MMP-2、MMP-9与脑缺血再灌注损伤

脑缺血后早期的血流再通有助于保护缺血半暗带，而后期的再灌注却加重组织损伤。脑缺血再灌注后MMPs表达增加，尤以MMP-2 和MMP-9活性增强最为明显，MMPs通过降解ECM、使基底膜模糊、断裂、水肿，出现节段性溶解、脱落、缺损，微血管结构完整性受损，通透性增高,引起毛细血管内水分和血浆蛋白外渗,导致细胞间隙内水分增多，即形成血管源性脑水肿。李建生等〔13〕采用大脑中动脉线栓法(MCAO)复制脑缺血模型，观察神经症状积分、梗死面积、病理变化、基底膜Ⅳ型胶原(ColⅣ)和层连蛋白(LN)。结果显示脑I/R损伤与微血管基底膜ColⅣ 和LN降解有关，随再灌注时间的延长而加重。脑缺血3 h时ColⅣ 和LN变化不明显，I/R 6 h、12 h显著降解并逐渐加重，I/R 24 h降解达到峰值，I/R 6 d损伤趋势有所减缓。孙晓伟等〔14〕亦采用MCAO法，用免疫组化技术分别观察脑缺血再灌注后不同时相点MMP-9 蛋白表达的变化。结果显示缺血再灌注后MMP-9含量随再灌注时间而呈动态变化，再灌注4 h开始升高，12 h增加明显，4～48 h时达到高峰，随后有所减低，从而证明MMP-9参与了脑缺血再灌注后 BBB 的破坏以及继发性脑水肿的形成。Liu等〔15〕研究表明：雌激素能减轻缺血再灌注后脑水肿和神经细胞损伤程度，其机制就是通过MMP-2、MMP-9的表达和活性介导。

组织型纤溶酶原激活物(rt-PA)是目前治疗急性缺血性脑卒中最有效的措施之一，其严重的并发症是脑内出血。有研究表明rt-PA溶栓治疗引起的出血与再灌注后MMPs的过度活化，使胶原、层黏连蛋白、基底膜等脑血管中的重要蛋白被降解，从而破坏血管结构的完整性有密切关系。Rosenberg等〔16〕假设脑梗死后缺血与脑缺血再灌注损伤引发MMP-9的表达，MMP-9的表达诱导TNF、IL等细胞因子、部分趋化因子以及氧自由基等参与的一系列连续反应。MMPs酶原的激活，尤其是MMP-9酶原的激活是蛋白酶参与BBB破坏反应的关键，这一过程涉及其他蛋白酶和氧自由基等的参与，MMP-9的激活需要MMP-3，氧自由基的作用,而MMP-3自身的激活可能需要纤维蛋白溶酶的作用。MMP-9激活后引起的BBB迟发性开放(再灌注24～48 h),导致血管源性脑水肿和出血性转化。

4 MMP-2、MMP-9抑制剂与脑缺血微血管损伤

大量的研究表明脑缺血溶栓治疗在挽救缺血半暗带的同时，增加了颅内出血和血管源性水肿的风险。脑缺血和缺血再灌注时MMPs水平升高，使用合成的TIMP可不同程度地抑制上述改变,减轻BBB损伤，缓解继发的血管源性脑水肿及出血性转化。Pfeferkorn等〔17〕的研究提示，应用TIMP (BB-94)可使rt-PA溶栓治疗的并发症的发生率降低，从而有望使溶栓治疗的时间窗有所延长并减少因溶栓所致的出血性并发症。由此可知，在脑缺血再灌注的过程中及时通过TIMP对MMP-2、MMP-9进行干预，可能成为缺血性脑血管疾病的新途径，亦为寻找新的治疗靶点提供依据。Rosenberg等〔18〕近期研究表明再灌注损伤可使BBB形成双向开放，由于MMP-2的激活导致再灌注损伤在BBB开放的早几个小时内即可出现。早期的BBB开放只是短暂的,在24～48 h后由于MMP-9和MMP-3的激活可造成更严重的血管损伤。TIMP仅对恢复早期再灌注造成的血管损伤有帮助,因为TIMP在保护血管的同时抑制了血管和神经的重塑，影响了康复。

5 问题及展望

综上所述，在脑缺血/再灌注损伤中MMP-2、-9可降解ECM，改变血管通透性，参与血管源性脑水肿和脑出血机制方面已达共识。在TIMP可抑制明胶酶的表达，调节MMPs对ECM破坏、在脑缺血/再灌注过程中起到保护作用的机制也逐渐得到认可。MMPs与TIMP的相关研究多集中在动物实验方面，临床研究较少，动物实验结果与临床实际疗效尚存在一定的差距；MMPs的激活通路十分复杂，除了脑组织缺血缺氧和脑缺血/再灌注可导致MMs的过度表达，纤溶酶系统作为血管基底膜和ECM降解的主要酶类其激活MMPs的通路尚不清楚。另外，关于TIMP对MMP-2、-9的调节作用机制仍未明了，TIMP与纤溶酶原激活物之间是否也存在相互作用等问题皆需要进一步的研究；与MMPs、TIMP研究的整体水平相比，有关中医药对MMPs、TIMP干预作用的研究报道较少。

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