基于实时细胞分析的化合物48／80诱导肥大细胞脱颗粒评价研究

王 曼，庄朋伟，周会芳，王诗羽，崔广智，张艳军

（天津中医药大学中药学院，天津 300193）

药物引起的过敏／类过敏反应是临床常见的不良反应之一。传统的过敏／类过敏反应评价方法多选用豚鼠，通过考察给药后豚鼠出现的喷嚏、抓鼻、呼吸困难、抽搐昏倒或死亡等现象，以判断药物是否可以引起过敏／类过敏反应［1］，存在实验周期性长、灵敏度低、误差大等缺点。大量研究表明［2］，药物作用于肥大细胞，激活并释放活性介质是引发过敏／类过敏反应的直接原因。因此，体外检测肥大细胞脱颗粒可以反映药物是否可以引起过敏／类过敏反应。

嗜碱性白血病细胞（RBL-2H3）具有肥大细胞的许多生物学特性，RBL-2H3被认为是体外检测脱颗粒反应的最佳模型［3］。

传统脱颗粒检测方法多需辅助外界染色剂或标记物来检测肥大细胞脱颗粒释放的物质［4－6］，且很难在活细胞的状态下观察脱颗粒现象。细胞脱颗粒时伴随细胞形态的改变，xCELLigence实时细胞分析系统（real-time cell electronic sensing，RT-CES），可以检测到电极板中细胞形态的变化，以细胞指数（cell index，CI）的形式显示［7］。本研究利用 RTCES系统，实时、快速、敏感的监测细胞发生脱颗粒的过程，初步建立了一种新的肥大细胞脱颗粒体外检测技术，为体外类过敏反应快速评价提供了一种新的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 RBL-2H3，购自于中国科学院细胞库，DMEM常规培养。

1.1.2 主要试剂及仪器 DMEM培养基（Gibco，美国，批号：8112118），胎牛血清（天津市中奥天原生物制品有限公司），0.25%胰酶（吉诺生物医药有限公司，批号：07121103），Compound 48／80（Sigma，美国，批号：1002340712），甲苯胺蓝（Sigma，美国，批号：1002341392），5%CO2恒温培养箱（美国Thermo Scientific Cytoperm公司），倒置相差显微镜（德国XD-101 98010），E-Plate 16电极板、xCELLigence实时细胞分析系统（RT－CES，美国艾森公司）。

1.2 细胞培养 RBL-2H3细胞用DMEM培养基（含15%胎牛血清），培养于37℃，饱和湿度，5%CO2培养箱中。RBL-2H3细胞为贴壁生长，当细胞生长铺满约80%培养瓶底面积时，可进行传代。传代比例为1∶3，4 d传代1次。

1．3 实时监测不同浓度Compound 48／80对RBL-2H3的影响 选择合适密度的RBL-2H3细胞，接种于E-Plate 16电极板，每孔100μl，监测24 h，待细胞增长稳定后，加入不同浓度 Compound 48／80，使终浓度达分别为 2.5、5、10、20、40、80 mg·L－1，并设置空白对照，每次监测间隔时间为5 min，监测48 h，检测CI值变化。

1.4 甲苯胺蓝染色 选择适宜密度的RBL-2H3细胞，接种于12孔板培养，待24 h细胞贴壁后，加入不同浓度Compound 48／80（5、10、20 mg·L－1），空白组加入等体积培养基，于37℃孵育1 h后，每孔加入0.5%的甲苯胺蓝染液进行染色，倒置相差显微镜下观察细胞脱颗粒形态的变化。

2 结果

2．1 不同浓度Compound 48／80对肥大细胞的影响 以合适的细胞密度接种于电极板中，稳定培养24 h，加入不同浓度Compound 48／80，RT-CES实时监测24 h。与空白对照组比较，Compound 48／80浓度为 20 mg·L－1时 Compound 48／80有明显改变肥大细胞正常增长规律，CI值在加药后30 min内呈现下降趋势，30 min～60 min CI值转为上升，60 min后又下降。结果提示，20 mg·L－1Compound 48／80引起的肥大细胞脱颗粒、变形，在RT-CES实时检测系统中表现出了特异性变化。浓度低于5 mg·L－1时对肥大细胞的生长曲线无明显影响；浓度高于40 mg·L－1时CI值明显下降，至48 h接近0点，说明此浓度明显抑制RBL-2H3生长。

2.2 甲苯胺蓝染色 甲苯胺蓝染色可检测肥大细胞脱颗粒的形态变化，为验证Compound 48／80引起RBL-2H3细胞在RT-CES系统中特征性曲线变化与脱颗粒的关系，本实验基于RT-CES系统曲线特异性变化，利用甲苯胺蓝染色方法，考察了 Compound 48／80不同浓度（5、10、20 mg·L－1）和不同作用时间（5、30、60 min）对RBL-2H3细胞脱颗粒的影响。空白对照组细胞生长良好，呈梭形或多形性，细胞核清晰可见，细胞质饱满，染成深蓝色；Compound 48／80浓度为5 mg·L－1组细胞状态与空白对照组类似，无明显变化；10 mg·L－1组细胞梭形逐渐变圆，细胞膜外有散在的颗粒；20 mg·L－1组的细胞梭形基本消失，细胞变圆或成蝌蚪状，细胞膜外有大量明显的颗粒。结果提示，RT-CES系统曲线特异性变化与RBL-2H3细胞变形、脱颗粒密切相关，RT-CES系统特异性曲线可以在一定程度上反映细胞脱颗粒现象。

3 讨论

本研究采用实时细胞分析系统，基于细胞形态的变化，可以实时检测药物引起的细胞状态的改变。通过实时检测传感器表面的电阻抗信号，以CI值来反映细胞生长状态，其中包括细胞数量、细胞黏附、细胞活力和细胞形态及细胞骨架动力学变化［8－9］。

Compound 48／80是引起肥大细胞脱颗粒反应的的工具药［10］，运用RT-CES系统实时检测不同浓度Compound 48／80引起RBL-2H3脱颗粒的变化，可发现60 min内，不同浓度的CI值曲线都有变化，以20 mg·L－1组的变化最明显，这是细胞脱颗粒及形态变化产生的，在甲苯胺蓝染色实验中得到了验证。此方法实现了实时、敏感监测肥大细胞脱颗粒且不损伤细胞。

本实验初步探讨了基于RT-CES系统的体外肥大细胞脱颗粒检测方法。RT-CES特异性曲线变化可以在一定程度反映肥大细胞脱颗粒现象。但由于此方法的初步建立，尚未考察肥大细胞脱颗粒具体量化标准，如CI值在哪个具体数值时肥大细胞开始发生脱颗粒，CI值的变化与炎性介质释放的关系等问题，均有待进一步深入研究。

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