索拉非尼联合吉西他滨对k-ras基因突变肺癌细胞株的增殖抑制作用及其机制

李 静，潘跃银，张 颖

（安徽医科大学1.附属省立医院干部病房，安徽合肥 230001；2.第一附属医院肿瘤科，安徽 合肥 230022；3.第三附属医院干部病房，安徽合肥 230061）

肺癌是目前最常见、致死率最高的恶性肿瘤之一，其中80%～85%为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］。目前，靶向抗癌药物，包括表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors，EGFRTKIs）被批准作为肺癌的二线治疗。有研究报道，EGFR-TKIs对EGFR基因突变的肺癌患者有效［2］，而对k-ras基因突变的肺癌患者无效［3－4］。在肺癌中，k-ras基因突变的患者占15%～30%，这些患者对化疗药物以及EGFR-TKIs耐药，预后很差［5］。索拉非尼是一种小分子多靶点的酪氨酸酶抑制剂，当前被美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准用于治疗晚期肾细胞癌［6］。本研究旨在初步探讨索拉非尼单药以及联合细胞毒药物吉西他滨对k-ras基因突变的肺癌细胞株的增殖抑制作用及其机制，为k-ras基因突变的NSCLC的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 EGFR-TKIs耐药、k-ras基因突变的人非小细胞肺癌H460、A549细胞株购买自ATCC公司；索拉非尼由德国拜耳公司赠送；吉西他滨购买自法国礼来公司；胎牛血清和RPMI 1640购自美国Hyclone公司；噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、PI染液购自美国 Sigma公司；β-actin、erk、p-erk、bcl-2抗体购自美国Cell Signal Technology公司。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 H460、A549细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液（内含青霉素100 U·L－1、链霉素 100 mg·L－1）培养，置于含 5%CO2、37℃恒温培养箱中。每1～2 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。

1.2.2 MTT法检测抗增殖效应 采用MTT法检测索拉非尼和吉西他滨对H460和A549细胞株的增殖抑制率。将细胞经胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为4×107个·L－1，铺于96孔板中。将索拉非尼和吉西他滨单药分别按照0.78～25μmol·L－1和 0.78～25 nmol·L－1的浓度范围作用于细胞72 h。药物作用结束前4 h，每孔加入20μl的MTT（5 g·L－1），培养 4 h后，再每孔加入 150μl DMSO，完全溶解甲臜。以空白对照孔调零，在490 nm波长处用自动酶标仪测定每孔的吸光度（OD）值。细胞抑制率／%＝［1－（加药组OD值－空白对照组OD值）／（细胞对照组OD值－空白对照组OD值）］×100%。采用CompuSyn软件计算单药处理组IC50值。

1.2.3 MTT法检测索拉非尼和吉西他滨的联合指数（combination index，CI） MTT实验方法同上，联合给药方式按照索拉非尼和吉西他滨药物的1／8、1／4、1／2、1、2和4倍的半数抑制浓度（half inhibitory concentration，IC50）的恒定比率联合给药，作用72 h。采用CompuSyn软件计算联合指数值。CI＞1，CI＝1，CI＜1分别代表拮抗，相加，协同效应。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞周期的变化 取对数生长期细胞，以1×108个·L－1的细胞密度1 ml每孔接种于6孔板中，恒温培养箱中孵育24 h后，索拉非尼和吉西他滨单药以及联合作用72 h，处理浓度为各药物的IC50值，药物作用结束后，吸除培养液，PBS洗2次，细胞胰酶消化，将悬浮液转移至离心管，离心，去上清，PBS洗2次，加入PI染液，室温避光30 min后，上流式细胞仪进行检测，采用ModF-it软件分析细胞周期分布。实验重复3次。

1.2.5 蛋白质印迹法检测p-erk、erk及bcl-2的蛋白表达 取对数生长期细胞，以1×109个·L－1的细胞密度2 ml每瓶接种在细胞培养瓶内。经24 h贴壁后，分别加入索拉非尼和吉西他滨单药以及联合作用72 h，处理浓度为各药物的IC50值，药物处理结束后，提取对照组及药物处理组的蛋白，BCA法测定蛋白浓度，将蛋白样品加入10%SDS-聚丙烯凝胶中电泳分离，经转膜，封闭后，加入 p-erk1／2、erk1／2和 bcl-2一抗（1∶1 000）后4℃孵育过夜，再加入二抗常温孵育1 h，最后暗室加入ECL发光液，胶片曝光。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析。各实验至少重复3次，数据资料用¯x±s表示，两组间均数比较用t检验，各组的组间均数比较用方差分析。

Fig 1 Antiproliferative effects of gemcitabine（A）and sorafenib（B）in H460 and A549 cells（n＝3）

Fig 2 The combination index（CI）values of sorafenib and gemcitabine in H460 and A549 cells analyzed by CompuSyn software

2 结果

2．1 索拉非尼和吉西他滨单药对H460和A549细胞的增殖抑制影响 MTT法检测结果显示，不同浓度的索拉非尼和吉西他滨对H460和A549细胞增殖抑制率的影响如Fig 1所示。索拉非尼作用于H460和A549细胞72 h的 IC50值分别是（2.71±0.07）μmol·L－1和（4.91±0.14）μmol·L－1。吉西他滨作用于H460和A549细胞72 h的IC50值分别是（6.59±0.19）nmol·L－1和（9.6±0.48）nmol·L－1。

2．2 索拉非尼联合吉西他滨对H460和A549细胞的协同作用 经CompuSyn软件计算，不同浓度索拉非尼联合吉西他滨对H460和A549细胞的CI值均小于1（Fig 2）。结果证明，索拉非尼联合吉西他滨对H460和A549细胞株有协同抗增殖作用。

2．3 索拉非尼和吉西他滨单药以及联合对H460细胞周期的影响 如Fig 3所示，与对照组相比，索拉非尼组 G0／G1期比例增加 （P＜0.01，F＝156.72），吉西他滨组 G0／G1期比例下降（P＜0.01，F＝156.72）。与对照组相比，吉西他滨组S期细胞比例明显增加（P＜0.01）。两药联合作用于H460细胞72 h后，G0／G1期比例增加（P＜0.01），同时 S期细胞比例也增加（P＜0.05）。

2．4 索拉非尼和吉西他滨单药以及联合对H460细胞p-erk、erk以及bcl-2的影响 索拉非尼作用于H460细胞72 h后，p-erk以及bcl-2下调，与对照组相比，p-erk／erk以及 bcl-2／β-actin的比值分别为0.45和0.53。而吉西他滨以IC50浓度作用于H460细胞72 h后，p-erk以及bcl-2上调，p-erk／erk以及bcl-2／β-actin的比值分别为1.36和2.30。两药联合作用72 h后，p-erk以及bcl-2与吉西他滨组相比明显下调，p-erk／erk以及 bcl-2／β-actin的比值分别为0.48和0.78（Fig 4、5）。

Fig 3 Cell cycle analysis on H460 cells treated with sorafenib and gemcitabine alone and in combination for 72h by flow cytometry

Fig 4 Expressions of p-erk1／2，erk1／2 and bcl-2 in H460 cells detected by Western blot．

Fig 5 Ratios of p-erk／erk and bcl-2／β-actin calculated in comparison with control，which was regarded as 1．0．

3 讨论

RAS-RAF-MEK-ERK信号通路调节了细胞的增殖、分化、存活、迁移的功能，这条通路的活化不仅可以导致细胞的恶性转化，还与肿瘤细胞的侵袭转移相关［7］。在 NSCLC中，k-ras基因突变直接导致RAF-MEK-ERK下游通路的激活，而索拉非尼可以作用于RAF激酶，直接抑制RAF-MEK-ERK下游通路［8］，所以对k-ras基因突变的NSCLC可能非常有效。本实验证明了索拉非尼对k-ras基因突变的非小细胞肺癌细胞株有增殖抑制作用，人体可耐受剂量［9］的72 h抑制率＞90%，提示索拉非尼可能成为NSCLC的新的靶向治疗药物。

本研究发现索拉非尼联合吉西他滨有协同抗增殖效应。索拉非尼与吉西他滨均为细胞周期特异性阻滞药物，两药联合使用未出现细胞周期的相互干扰，且受药物作用的G0／G1期和S期细胞比例增加。

本研究证明，吉西他滨作用于H460细胞72 h后，p-erk与bcl-2的明显上调，激活了 RAF-MEKERK信号通路。而索拉非尼作用于H460细胞72 h后p-erk下调，抑制了RAF-MEK-ERK通路，bcl-2同时下调也证明了抑制RAF-MEK-ERK这一通路是索拉非尼诱导凋亡的重要机制。两药联合作用72 h后，p-erk与bcl-2水平与吉西他滨组相比明显下降，说明当两药联合使用时，索拉非尼可以抑制吉西他滨对下游通路的激活，从而对其发挥最大细胞毒性作用起到了协助作用。

索拉非尼是多靶点的靶向药物，作用机制较为复杂，本研究为体外试验，索拉非尼联合吉西他滨在体内的抗肿瘤效应及机制仍需深入研究探讨。

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